CCL5/RANTES Antibody (Mouse mAb) [K11A8]
目录号: F4576
抗体应用：
反应性：
-
Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded mouse intestinal tissue with F4576 at 1:20 dilution.
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：20%。
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：20%。
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC, FCM |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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10 kDa
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| 阳性对照 | Mouse small intestine |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
CCL5/RANTES Antibody (Mouse mAb) [K11A8] 可检测内源性 CCL5/RANTES 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞外环境 |
| Uniprot ID |
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| P13501 |
| 克隆号 |
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| K11A8 |
| 别名 |
|---|
| C-C motif chemokine 5, EoCP, Eosinophil chemotactic cytokine, SIS-delta, Small-inducible cytokine A5, T cell-specific protein P228 (TCP228), T-cell-specific protein RANTES, CCL5, D17S136E, SCYA5 |
| 背景 |
|---|
CCL5，最初名为RANTES（Regulated upon Activation, Normal T cell Expressioned and presumed Secreted，即激活后调节的正常T细胞表达并可能分泌），属于CC趋化因子亚家族，通过三种G蛋白偶联受体CCR1、CCR3和CCR5传递信号，其中CCR5是其主要且研究最为深入的受体。CCL5由典型的CC趋化因子二聚体通过聚合机制组装成更高级的棒状双螺旋寡聚体，这种寡聚化与细胞表面和细胞外基质中的糖胺聚糖（GAG）结合偶联。CCL5中带正电荷且完全暴露的KKWVR基序介导GAG相互作用，这与CCL3等相关趋化因子使用的埋藏式BBXB基序不同。破坏二聚体-二聚体相互作用的关键残基（包括E66和E26）的突变会导致CCL5寡聚体解聚，从而将特定的带电残基直接与高级组装过程联系起来，而非与受体结合本身相关。这种寡聚化和GAG结合活性是功能必需的，而非偶然的：CCR1介导的白细胞在炎症内皮上的黏附特异性地依赖于CCL5寡聚化，而CCR5介导的白细胞跨内皮迁移则独立于寡聚体的形成，这表明这两个受体结合的是功能不同的趋化因子形式，从而导致白细胞黏附级联反应的不同步骤。 CCL5与受体结合后，诱导CCR5发生构象变化，激活异源三聚体G蛋白亚基，进而引发环磷酸腺苷（cAMP）、三磷酸肌醇（IP3）和细胞内钙离子水平的变化，并激活酪氨酸激酶。这些信号事件驱动细胞极化和NF-κB易位，增强吞噬能力、促进细胞存活和促炎基因的转录。CCL5还能与其他趋化因子（如CXCL4）形成异源寡聚体，尤其是在血小板活化后CXCL4过量存在的情况下。这种异源寡聚体复合物改变了组装体的表面电荷分布，使其能够比单独形成的CCL5寡聚体更紧密地结合糖胺聚糖（GAG），从而扩展了CCL5的功能范围，使其超越了同型自组装的范畴。在肿瘤微环境中，CCL5-CCR5信号通路募集调节性T细胞和髓源性抑制细胞，极化肿瘤相关巨噬细胞，促进上皮-间质转化，并稳定PD-L1表达，从而将炎症环境中建立的寡聚化和糖胺聚糖依赖性机制与促肿瘤发生过程和治疗耐药性联系起来。此外，在实验性肝损伤模型中，CCL5还通过CCR1和CCR5信号通路促进纤维化进展，而受体拮抗剂可减轻纤维化瘢痕，这凸显了CCL5-CCR1/CCR5轴在炎症、纤维化和肿瘤疾病中作为明确靶点的重要性。 |
| 参考文献 |
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