CD10/Neprilysin Antibody (Rabbit mAb) [J20L24]
目录号: F5284
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Raji, Lane 2: Ramos, Lane 3: Mouse lung, Lane 4: Rat lung
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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86 kDa
100 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Rat lung tissue; Human placenta tissue; Rat kidney tissue; Mouse kidney tissue; Human diffuse large B-cell lymphoma tissue; Human tonsil tissue; Human kidney tissue; Mouse lung tissue; HAP1 cells; Raji cells; Ramos cells |
|---|---|
| 阴性对照 | HT-29 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| CD10/Neprilysin Antibody (Rabbit mAb) [J20L24] 可检测内源性 CD10/Neprilysin 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞膜，内膜系统 |
| Uniprot ID |
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| P08473 |
| 克隆号 |
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| J20L24 |
| 别名 |
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| CD10, EPN, MME, Neprilysin, Atriopeptidase, Common acute lymphocytic leukemia antigen, Enkephalinase, Neutral endopeptidase 24.11, Skin fibroblast elastase, CALLA, NEP, Neutral endopeptidase, SFE |
| 背景 |
|---|
| CD10，又称脑啡肽酶、中性内肽酶、膜金属内肽酶和CALLA，属于M13锌依赖性金属内肽酶家族，是一种锚定于质膜的II型跨膜蛋白，其催化胞外结构域位于细胞外，可直接在细胞表面降解分泌的小肽。该酶具有相对广泛的底物特异性，但表现出明确的切割偏好性，特异性水解疏水残基氨基末端侧的肽键。这一机制规则决定了脑啡肽酶能够处理哪些生物活性肽，并解释了其对包括脑啡肽、心房利钠肽、缓激肽和β-淀粉样蛋白在内的多种化学结构不同的底物的活性。在这些底物中，β-淀粉样蛋白受到了特别关注，因为脑啡肽酶是清除脑组织中这种肽的主要酶之一，并且脑啡肽酶水平与人脑组织中的β-淀粉样蛋白肽浓度和淀粉样斑块负荷之间存在反比关系，此外，随着颞叶和额叶皮质的正常衰老，脑啡肽酶水平还会下降，这种下降被认为会导致β-淀粉样蛋白随着时间的推移而积累增加。对作用于淀粉样蛋白β 1-40 的野生型酶进行动力学表征，确定了该底物的明确米氏常数。通过对可溶性脑啡肽酶胞外结构域进行蛋白质工程改造，提高了其对淀粉样蛋白β的催化效率，产生了一种变体，其对淀粉样蛋白β 1-40 的催化效率比野生型酶高约20倍。这直接证明了脑啡肽酶的底物结合裂隙可以通过结构修饰来促进淀粉样蛋白β的降解，使其优于其他许多生理底物。鉴于脑啡肽酶天然的广泛底物特异性限制了其在不进行此类修饰的情况下作为阿尔茨海默病治疗药物的应用，这一特性与治疗工程直接相关。在神经元中，脑啡肽酶的表达和活性受尼卡斯特林调控。尼卡斯特林是γ-分泌酶复合物的组成部分，它还执行蛋白水解步骤，将淀粉样前体蛋白转化为β-淀粉样蛋白，从而将负责β-淀粉样蛋白生成的酶与控制其清除酶的调控信号联系起来。除了在中枢神经系统中的作用外，CD10还在肾脏、肺、中性粒细胞和淋巴组织中广泛表达。在这些组织中，CD10通过灭活与血压和体液平衡相关的利钠肽和激肽来终止信号传导。CD10是淋巴系统恶性肿瘤（包括某些淋巴瘤和B淋巴母细胞白血病）中临床认可的免疫组织化学标志物，这反映了其在淋巴细胞发育不同阶段的差异表达。 |
| 参考文献 |
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