CD177 Antibody (Rabbit mAb) [L24N17]
目录号: F6417
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Recombinant human CD177 protein
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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46 kDa
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| 阳性对照 | Human liver; Human lung; Human spleen; Human bone marrow; Neutrophils in human placenta tissue; Neutrophils in human spleen; Recombinant his-tagged human CD177 protein (aa22-407) |
|---|---|
| 阴性对照 | U-937 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| CD177 Antibody (Rabbit mAb) [L24N17] 可检测内源性 CD177 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞膜，细胞突起，内膜系统，细胞外环境 |
| Uniprot ID |
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| Q8N6Q3 |
| 克隆号 |
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| L24N17 |
| 别名 |
|---|
| CD177, NB1, PRV1, UNQ595/PRO1181, CD177 antigen, Human neutrophil alloantigen 2a, NB1 glycoprotein, Polycythemia rubra vera protein 1, HNA-2a, NB1 GP, PRV-1 |
| 背景 |
|---|
| CD177，又称中性粒细胞抗原NB1或真性红细胞增多症-1，是一种糖基磷脂酰肌醇锚定的Ly6/uPAR家族糖蛋白，主要表达于部分人类中性粒细胞及其前体细胞上。它作为中性粒细胞特异性受体，调控与炎症和血管炎相关的表面蛋白酶和黏附信号。其胞外区包含多个LU结构域，形成球状头部，并通过柔性连接子与下游片段相连，为包括蛋白酶3 (PR3) 和内皮细胞黏附受体在内的结合伙伴提供结构化的界面。CD177作为成熟PR3的高亲和力受体，捕获中性粒细胞表面的蛋白酶，使大部分膜结合的PR3存在于CD177:PR3复合物中。 CD177 的前两个 LU 结构域构成了一个主要由疏水性物质组成的结合界面，该界面将 PR3 的 CD177 结合表面定义为肉芽肿性多血管炎中主要的 ANCA 靶表位。CD177 的表达将中性粒细胞分为 CD177 阳性/膜 PR3 高表达和 CD177 阴性/膜 PR3 低表达两类细胞群。CD177 和膜 PR3 表达的升高与 ANCA 相关性系统性血管炎和系统性红斑狼疮相关，在这些疾病中，PR3-ANCA 结合会触发氧化爆发和脱颗粒。PR3 上 CD177 结合位点的结构导向突变会降低 ANCA 的结合，这凸显了 CD177-PR3 界面在自身抗体识别和效应细胞活化中的功能重要性。 CD177 还作为一种异嗜性黏附受体，通过与内皮细胞上的血小板内皮细胞黏附分子-1 (PECAM-1) 结合，并与 β2 整合素（如 Mac-1 (ITGAM/ITGB2)）相互作用；这些相互作用调节中性粒细胞的跨内皮迁移、脱颗粒和超氧化物生成。CD177 通过阻止 β2 整合素内化和减弱趋化因子信号传导，在特定的炎症环境下，使中性粒细胞倾向于黏附而非迁移。在炎症条件下，CD177 表达上调，CD177+ 中性粒细胞聚集在炎症的黏膜和血管部位，在那里它们调节炎症介质的释放，形成中性粒细胞胞外陷阱，并影响炎症性肠病、急性呼吸窘迫综合征和血管炎症等疾病中的屏障完整性和组织损伤。在多种实体瘤中，上皮细胞和肿瘤浸润性调节性T细胞上的CD177表达与肿瘤侵袭、疾病分期和患者生存率相关，提示其在肿瘤微环境信号传导和免疫调节中可能发挥其他作用。CD177的基因变异会影响其表达和IgG介导的功能，而近期研究发现CD177是一种新型的IgG Fc受体，参与抗体依赖性效应机制，进一步拓展了其在自身免疫和宿主防御中的作用。 |
| 参考文献 |
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