CD39 Antibody (Rabbit mAb) [A7P6]
目录号: F2610
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: IM-9
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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58 kDa
78 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human pancreas tissue; Human endometrial carcinoma tissue; Human liver tissue; Human placenta tissue; Human heart tissue; IM-9 cells; Human PBMC cells; THP-1 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | Jurkat cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| CD39 Antibody (Rabbit mAb) [A7P6] 可检测内源性 CD39 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 内膜系统 |
| Uniprot ID |
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| P49961 |
| 克隆号 |
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| A7P6 |
| 别名 |
|---|
| 2610206B08Rik | AA408691 | Cd39 | CD39 antigen | E130009M23Rik | Ecto-apyrase | Ecto-ATP diphosphohydrolase 1 | Ecto-ATPase 1 | Ecto-ATPDase 1 | ectoa | ectoapyrase | Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 | ENTP1 | Entpd1 | Lymphoid cell activation antigen | NTPDa | NTPDase 1 | NTPDase-1 |
| 背景 |
|---|
| CD39 (ENTPD1) 是 E-NTPDase 家族的典型胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶，它通过两个短的跨膜区段锚定在质膜上，这两个区段侧翼是一个大的胞外催化环。CD39 能够依次水解胞外核苷三磷酸和二磷酸（例如 ATP 和 ADP）生成 AMP，从而调节血管和免疫系统中嘌呤能信号的强度、持续时间和化学性质。胞外结构域包含保守的腺苷三磷酸酶特征基序和金属结合残基，这些残基能够配位二价阳离子以及 ATP 或 ADP 的 γ- 和 β-磷酸基团，使 CD39 能够分步去除两个磷酸基团，并将促炎的、血小板激活的 ATP/ADP 转化为 AMP。AMP 随后被胞外 5'-核苷酸酶 CD73 去磷酸化生成腺苷。由此可见，CD39 在 ATP→ADP→AMP→腺苷级联反应中发挥着限速酶促作用。在血管界面，内皮细胞和血小板上表达的 CD39 通过水解细胞外空间的 ATP 和 ADP 来调控血栓形成，从而阻断 P2Y 受体介导的血小板聚集，限制微血管血栓形成并维持血流。CD39 活性的基因或药理学破坏会增加血栓形成和缺血再灌注损伤的易感性，凸显了其在维持止血平衡中的重要性。在免疫学中，CD39广泛表达于B细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、活化的效应T细胞和调节性T细胞上，其磷酸水解活性通过清除炎症、缺氧或细胞损伤期间释放的促炎性ATP，并促进免疫抑制性腺苷通过CD73积累，从而塑造T细胞的活化、极化和稳定性，进而将环境从ATP驱动的P2受体信号（钙动员、趋化性、炎症小体激活）转变为P1受体介导的抗炎信号。传统T细胞和调节性T细胞上的CD39表达受细胞因子和微环境信号的动态调控，CD39⁺ Tregs通过ATP降解和腺苷生成，在自身免疫和移植中表现出增强的抑制效应反应的能力；而在细胞外ATP浓度升高的炎症组织中，高水平的CD39赋予T细胞介导的免疫调节竞争优势。在癌症中，肿瘤内T细胞、髓系细胞以及有时肿瘤细胞本身上的CD39表达上调，综述强调CD39与CD73共同驱动凋亡细胞释放的免疫刺激性ATP转化为免疫抑制性腺苷，从而建立富含腺苷的肿瘤微环境，该微环境通过A2A和A2B受体抑制细胞毒性T细胞和NK细胞的功能，并促进肿瘤进展；因此，CD39被视为一种免疫开关和新兴的免疫检查点靶点，阻断CD39的治疗作用被认为可以通过维持ATP信号传导和减少腺苷积累来增强抗肿瘤免疫。CD39失调与一系列免疫相关疾病有关，包括炎症性肠病、脓毒症、多发性硬化症、过敏性疾病、系统性红斑狼疮、糖尿病和血管炎症状态，这反映了其在细胞外核苷酸代谢、血栓形成和炎症之间交汇点的核心地位。 |
| 参考文献 |
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