CD54/ICAM-1 Antibody (Rabbit mAb) [L16P13]
目录号: F7639
抗体应用：
反应性：
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Lane 1: Mouse spleen, Lane 2: Mouse liver, Lane 3: Mouse kidney
客户使用该产品的实验数据
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Mouse |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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58 kDa
80-110 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Mouse liver tissue; Mouse kidney tissue; Mouse spleen tissue; Mouse lung tissue; bEnd.3 cells; A20 cells; RAW 264.7 cells; WEHI-231 cells |
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| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| CD54/ICAM-1 Antibody (Rabbit mAb) [L16P13] 可检测内源性 CD54/ICAM-1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| P05362 |
| 克隆号 |
|---|
| L16P13 |
| 别名 |
|---|
| CD54 | Intercellular adhesion molecule 1 | ICAM-1 | MALA-2 | MyD10 | Icam1 |
| 背景 |
|---|
| 细胞间黏附分子1 (ICAM1) 是一种免疫球蛋白超家族细胞黏附受体，在内皮细胞和多种白细胞上以低水平基础表达，并可被促炎细胞因子强烈诱导。ICAM1 在白细胞迁移和免疫突触形成中发挥着核心组织作用。其胞外结构域由多个Ig样结构域组成，这些结构域可与β2整合素结合，包括ITGAL:ITGB2 (LFA-1) 和ITGAM:ITGB2 (Mac-1)，以及其他配体，例如纤维蛋白原和透明质酸。其短的胞内尾部与肌动蛋白细胞骨架和信号转导衔接蛋白连接，从而支持黏附过程中的由外向内信号传导。 T细胞上的LFA-1与ICAM1结合，可稳定T细胞与内皮细胞和T细胞与抗原呈递细胞之间的接触，并促进免疫突触的形成，从而提供一个可调控的黏附系统，使T细胞受体信号强度能够转化为稳定的结合物形成、共刺激以及有效的细胞毒性或辅助性免疫应答。在剪切应力作用下，活化中性粒细胞上的Mac-1与受刺激内皮细胞上的ICAM1结合，支持中性粒细胞的牢固黏附和爬行，使其定位以进行跨内皮迁移至炎症部位。在白细胞跨内皮迁移过程中，ICAM1的配体结合通过募集ARHGEF26/SGEF并激活小GTP酶RHOG，触发富含F-肌动蛋白和caveolae的内皮细胞“顶端杯”的组装，从而重塑黏附白细胞周围的内皮表面并促进白细胞渗出。 ICAM1的结合还能通过Ca²⁺和AMP激活蛋白激酶激活内皮型一氧化氮合酶，从而将细胞黏附与血管调节和屏障信号通路联系起来，进而影响白细胞的通过。在信号传导层面，ICAM1交联诱导酪氨酸磷酸化级联反应、激酶激活和转录因子结合，导致细胞因子生成、膜蛋白表达、活性氧产生以及在某些情况下促进细胞增殖，使其不仅仅是一个被动的黏附锚定点。ICAM1表达的转录调控由启动子元件驱动，其中包括一个对TNF、IL-1、LPS和佛波酯有反应的κB位点，而糖皮质激素则抑制其表达，这表明ICAM1属于NF-κB依赖性炎症基因通路，该通路可通过药物进行调控。 ICAM1 在上皮细胞和肿瘤细胞上高表达，参与细胞间聚集，例如通过与黏蛋白 MUC1 相互作用，并通过与 T 细胞整合素的共刺激相互作用促进抗原呈递和细胞毒性 T 细胞活化。可溶性 ICAM1 可在血浆中检测到，并在多种病理状态下升高，包括恶性肿瘤、自身免疫性疾病和过敏性疾病、动脉粥样硬化、缺血和移植排斥反应，因此 ICAM1 可作为炎症和免疫失调的有效生物标志物。 |
| 参考文献 |
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