CD63 Antibody [P10C2]

目录号: F5010

抗体应用：反应性：Human, Monkey

Lane 1: THP-1, Lane 2: COS-7

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

操作要点

WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。

使用信息

稀释比例
WB1:1000

抗体应用
WB

反应性
Human, Monkey

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
25-60 kDa

阳性对照	THP1 cells; 293T cells; SK-MEL-28 cells; COS-7 cells
阴性对照	Jurkat cells; MOLT-4 cells

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
CD63 Antibody [P10C2] 可检测内源性 CD63 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞膜，内体，溶酶体，内膜系统，细胞外环境

Uniprot ID
P08962

克隆号
P10C2

别名
CD63 antigen; Granulophysin; Lysosomal-associated membrane protein 3 (LAMP-3); Limp1; Melanoma-associated antigen ME491; OMA81H; Ocular melanoma-associated antigen; Tetraspanin-30 (Tspan-30); CD63; MLA1; TSPAN30

背景
CD63 是一种（糖基化的）溶酶体相关膜蛋白 3 (LAMP3)，属于四跨膜蛋白超家族，广泛表达于造血细胞、内皮细胞和黑色素细胞谱系中，它组织富含四跨膜蛋白的微区 (TEM)，以协调整合素信号传导、内体分选和细胞外囊泡 (EV) 的生物发生。CD63 具有四个跨膜结构域 (TM1–4)，形成两个紧密的发夹结构，包含一个小的胞外环 1 (ECL1，氨基酸 40–70；保守的 CCG 基序二硫键) 和一个大的胞外环 2 (ECL2，氨基酸 113–175；胆固醇结合掌状结构域，用于伴侣的侧向扩散)。胞质尾部（N端1-22/C端201-237）通过二亮氨酸基序募集syntenin-1和CD47，从而启动网格蛋白/小窝内吞作用。CD63支架蛋白介导PMEL腔内结构域分选至黑素体的腔内囊泡（ILV）中，启动淀粉样蛋白原纤维聚合（原纤维增加约4倍；CD63敲低导致溶酶体降解），进而促进ESCRT非依赖性多泡内体（MVE）的形成。CD63还连接内体-自噬通量，抑制mTORC1（降低p-mTOR水平并保留LAMTOR1），并调节EBV LMP1的分泌，平衡信号转导（CD63敲除会增加LMP1和mTOR的过度激活，导致形成大的自噬空泡）。 CD63对于黑素体成熟（PMEL纤维形成）、血小板活化（Weibel-Palade小体融合）、肥大细胞脱颗粒（突触蛋白-4对接）和内皮通透性（VEGF-整合素αvβ3信号通路）至关重要，并且是外泌体标志物（约50%的细胞外囊泡富集）。CD63在黑色素瘤中表达上调，通过TEM-整合素αvβ3/ITGB1转运促进转移；CD63敲除破坏溶酶体稳态，使细胞对溶酶体抑制剂敏感，但矛盾的是，在结肠癌中，CD63却通过诱导细胞凋亡发挥抑癌作用。

背景

CD63 是一种（糖基化的）溶酶体相关膜蛋白 3 (LAMP3)，属于四跨膜蛋白超家族，广泛表达于造血细胞、内皮细胞和黑色素细胞谱系中，它组织富含四跨膜蛋白的微区 (TEM)，以协调整合素信号传导、内体分选和细胞外囊泡 (EV) 的生物发生。CD63 具有四个跨膜结构域 (TM1–4)，形成两个紧密的发夹结构，包含一个小的胞外环 1 (ECL1，氨基酸 40–70；保守的 CCG 基序二硫键) 和一个大的胞外环 2 (ECL2，氨基酸 113–175；胆固醇结合掌状结构域，用于伴侣的侧向扩散)。胞质尾部（N端1-22/C端201-237）通过二亮氨酸基序募集syntenin-1和CD47，从而启动网格蛋白/小窝内吞作用。CD63支架蛋白介导PMEL腔内结构域分选至黑素体的腔内囊泡（ILV）中，启动淀粉样蛋白原纤维聚合（原纤维增加约4倍；CD63敲低导致溶酶体降解），进而促进ESCRT非依赖性多泡内体（MVE）的形成。CD63还连接内体-自噬通量，抑制mTORC1（降低p-mTOR水平并保留LAMTOR1），并调节EBV LMP1的分泌，平衡信号转导（CD63敲除会增加LMP1和mTOR的过度激活，导致形成大的自噬空泡）。 CD63对于黑素体成熟（PMEL纤维形成）、血小板活化（Weibel-Palade小体融合）、肥大细胞脱颗粒（突触蛋白-4对接）和内皮通透性（VEGF-整合素αvβ3信号通路）至关重要，并且是外泌体标志物（约50%的细胞外囊泡富集）。CD63在黑色素瘤中表达上调，通过TEM-整合素αvβ3/ITGB1转运促进转移；CD63敲除破坏溶酶体稳态，使细胞对溶酶体抑制剂敏感，但矛盾的是，在结肠癌中，CD63却通过诱导细胞凋亡发挥抑癌作用。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29212935/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21962903/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%