CDC42 Antibody (Rabbit mAb) [B14M24]
目录号: F4204
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Jurkat, Lane 2: C6, Lane 3: NIH/3T3
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat, Bovine |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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21 kDa
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| 阳性对照 | Jurkat cells; C6 cells; NIH/3T3 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| CDC42 Antibody (Rabbit mAb) [B14M24] 可检测内源性 CDC42 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，细胞突起，细胞质 |
| Uniprot ID |
|---|
| P60953 |
| 克隆号 |
|---|
| B14M24 |
| 别名 |
|---|
| CDC42, CDC42Hs, Cell division control protein 42 homolog, cell division cycle 42, G25K, G25K GTP-binding protein, growth-regulating protein, GTP binding protein, 25kDa, GTP-binding protein, 25kD, small GTP binding protein CDC42, TKS |
| 背景 |
|---|
| CDC42 是一种小型 Rho 家族 GTP 酶，它作为一种保守的分子开关，调控肌动蛋白细胞骨架的组织、细胞极性、膜运输以及信号通路，从而调节多种哺乳动物组织的生长和分化。该蛋白包含一个典型的小 GTP 酶折叠，其 P 环 NTP 结合域、在 GTP 结合和水解后发生构象变化的开关 I 和开关 II 区，以及一个经异戊二烯化修饰的 C 端 CAAX 基序，该基序可将 CDC42 锚定在特定的膜区室，受体和支架蛋白可募集其特异性的鸟嘌呤核苷酸交换因子 (GEF) 和 GTP 酶激活蛋白 (GAP)。在 GEF（催化 GDP-GTP 交换）、GAP（加速内源性 GTP 水解）和 RhoGDI（结合 GDP 结合的 CDC42 并将其保留在胞质中，直至接收到适当的信号将其释放以进行膜靶向和激活）的协同作用下，CDC42 在 GDP 结合的非活性状态和 GTP 结合的活性状态之间循环。活性CDC42与多种效应蛋白相互作用，包括p21激活激酶、N-WASP/WASP和PAR极性复合物。这些效应蛋白将CDC42的激活与Arp2/3依赖的肌动蛋白成核、富含肌动蛋白的丝状伪足的形成、顶端-基底极性的建立以及黏附连接和紧密连接的组织联系起来，从而协调上皮形态发生、定向迁移以及管腔和屏障的形成。CDC42还与IQGAP蛋白、MRCK激酶以及高尔基体和质膜上的调节因子相互作用，将肌动球蛋白的收缩性与囊泡运输和微管动力学整合起来，从而塑造连接稳定性、极性分泌和细胞器定位。在内分泌组织中，葡萄糖刺激的CDC42激活作为胰岛素刺激-分泌偶联的早期信号发挥作用，CDC42调节皮质肌动蛋白重塑和胞吐机制的募集，而胞吐机制是胰岛素持续释放的第二时相所必需的。在控制细胞增殖和存活的信号网络中，CDC42调节EGFR-mTORC1等通路，并促进下游级联反应（包括MAPK和PI3K）的激活，进而影响转录程序和细胞周期进程。种系突变和CDC42活性失调与发育性疾病和自身炎症性疾病相关，而肿瘤中CDC42的过表达或过度激活则与肿瘤细胞的运动性增强、侵袭性和转移扩散相关。 |
| 参考文献 |
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