cIAP Pan-specific Antibody (Mouse mAb) [B1J9]
目录号: F6710
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Raji, Lane 2: Jurkat
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 反应性 |
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| Human, Mouse |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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68 kDa
80 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Raji cells; Jurkat cells; SW3T3 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| cIAP Pan-specific Antibody (Mouse mAb) [B1J9] 可检测内源性 cIAP Pan-specific 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q13489 |
| 克隆号 |
|---|
| B1J9 |
| 别名 |
|---|
| Cellular inhibitor of apoptosis 2 (C-IAP2), IAP homolog C, hIAP-1; hIAP1, RING finger protein 49, BIRC3, API2, MIHC, RNF49 |
| 背景 |
|---|
| cIAP1 和 cIAP2 是密切相关的凋亡抑制蛋白家族成员，它们具有 N 端串联杆状病毒 IAP 重复结构域、中央 caspase 募集结构域和 C 端 RING 指结构域（赋予其泛素 E3 连接酶活性），因此可作为 TNF 受体相关信号复合物和其他受体平台的支架酶。BIR 结构域能够结合 caspase 和其他信号蛋白，但序列分析和诱变实验表明，cIAP 的 BIR 结构域在有效抑制 caspase 的关键残基上存在氨基酸替换，因此它们的主要生化活性来源于 RING 依赖性泛素化，而非直接有效地阻断 caspase 活性。 RING结构域二聚化并与泛素化的E2酶相互作用，催化TNF受体1复合物中RIP1等底物上的K63和其他多聚泛素链的修饰，从而为TAK1、IKK和其他NF-κB通路组分创造结合位点，并在TNFα刺激后支持促生存和促炎转录反应。cIAP1或cIAP2均足以维持TNFα处理后RIP1的多聚泛素化和NF-κB的激活，而这两种蛋白的基因缺失会导致RIP1泛素化减少、NF-κB信号传导减弱以及RIP1-FADD-caspase-8复合物形成增加，从而促进细胞凋亡。 cIAPs还能自身泛素化并泛素化TNF及相关通路中的其他衔接蛋白，从而促进组分周转，并维持细胞因子和模式识别受体输入后存活信号和细胞死亡复合物之间的平衡。线粒体来源的Smac/DIABLO和HtrA2/Omi通过IAP结合基序与BIR结构域结合，促进cIAP1和cIAP2的RING依赖性自身泛素化和蛋白酶体降解，从而降低细胞内cIAP水平，并将死亡受体通路中的信号传导从NF-κB激活转向caspase-8激活和细胞凋亡。小分子Smac模拟物可与cIAP的BIR结构域结合，解除RING结构域的分子内抑制，诱导RING介导的快速自泛素化，并触发cIAP1（以及程度较轻的cIAP2）的蛋白酶体清除，从而为实验性地耗竭cIAP并研究由此产生的从促生存信号向促凋亡信号转变提供了一种工具。据报道，cIAP1和cIAP2在多种癌症中表达升高，它们对RIP1和其他靶点的E3泛素连接酶活性与维持组成型NF-κB活性和恶性细胞在应激条件下的存活有关；而cIAP功能的药理学或基因破坏则可使肿瘤细胞对TNF家族配体和化疗药物更加敏感。 |
| 参考文献 |
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