CIRP Antibody (Rabbit mAb) [P15P18]
目录号: F6726
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Mouse testis, Lane 2: Rat testis
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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19 kDa
18 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Mouse testis tissue; Rat testis tissue; NIH/3T3 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| CIRP Antibody (Rabbit mAb) [P15P18] 可检测内源性 CIRP 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q14011 |
| 克隆号 |
|---|
| P15P18 |
| 别名 |
|---|
| Cirp, Cirbp, Cold-inducible RNA-binding protein, A18 hnRNP, Glycine-rich RNA-binding protein CIRP |
| 背景 |
|---|
| CIRP（冷诱导RNA结合蛋白）是一种小型应激反应性RNA结合蛋白，其N端包含RNA识别基序（RRM），C端包含富含RG/RGG的调控结构域。CIRP最初被鉴定为一种由轻度低温诱导产生的蛋白，现在被认为是脊椎动物普遍存在的应激因子，能够协调转录后调控细胞存活、增殖和炎症通路。其模块化结构使其能够通过RRM特异性结合3′非翻译区（3′UTR）中的富含AU序列和其他元件。同时，精氨酸-甘氨酸-甘氨酸结构域发生磷酸化和甲基化，从而决定CIRP在细胞核和细胞质之间的穿梭以及其在应激颗粒中的募集，进而控制CIRP在不同应激条件下对特定靶转录本的结合。在冷休克、紫外线辐射、缺氧和感染等条件下，CIRP通过激活替代启动子的自身转录而表达增加，该蛋白从细胞核转移到细胞质，在那里稳定特定的mRNA，并能抑制或增强其翻译，从而作为应激反应基因表达的精细调节器而非简单的开关。已鉴定的靶标包括编码DNA修复、氧化还原和生存因子的转录本；例如，CIRP结合RPA2和TXN的3′非翻译区（3′UTR）以稳定其mRNA，并支持基因毒性应激反应和抗氧化能力，从而有助于在中等应激条件下抑制细胞凋亡和维持细胞骨架完整性。CIRP过表达时还能促进应激颗粒的组装，与停滞的翻译起始复合物和其他RNA结合蛋白（RBP）一起形成细胞质聚集体，这些聚集体在环境挑战期间瞬时储存和分选mRNA，其RG结构域对于核输出和有效的应激颗粒募集都是必需的。在细胞周期调控中，CIRP通过与富含AU的元件结合来调节CDK抑制剂p27^Kip1的翻译，诱导p27的产生，从而促进冷诱导的细胞增殖抑制和细胞周期的受控退出。在心脏中，CIRP作为窦房结细胞中磷酸二酯酶4B和4D转录本的mRNA稳定剂，维持PDE4的表达，抑制cAMP水平，并防止β-肾上腺素能应激引起的心率过度加快；CIRP敲除动物表现出过度的心动过速反应，凸显了其在心脏电生理可塑性和应激适应中的作用。在中枢神经系统中，CIRP根据其定位具有双相作用：核内和胞质中的CIRP通过稳定关键转录本来支持神经元存活和突触功能，而作为损伤相关分子模式（DAMP）释放的胞外CIRP则与模式识别受体结合并驱动神经炎症，从而导致缺血和神经退行性疾病等病理的发生。细胞外 CIRP 更广泛地成为脓毒症和癌症相关炎症中的促炎介质，它与 TLR4 或 Mincle 等受体结合，放大细胞因子产生并调节免疫细胞募集，为其细胞内 RBP 功能增添了免疫调节维度。 |
| 参考文献 |
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