CRX Antibody (Rabbit mAb) [F1B1]
目录号: F9907
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Y79
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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32 kDa
37 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human retina tissue; Mouse retina tissue; Rat retina tissue; Y79 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| CRX Antibody (Rabbit mAb) [F1B1] 可检测内源性 CRX 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞核 |
| Uniprot ID |
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| O43186 |
| 克隆号 |
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| F1B1 |
| 别名 |
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| CORD2, CRX, Cone-rod homeobox protein |
| 背景 |
|---|
| 锥杆同源框蛋白 (CRX) 是视网膜特异性的 Otx 家族 K50 同源域转录因子，它结合光感受器基因上游含有 ATTA 序列的顺式调控基序，例如 5′-TAATCC/A-3′，并驱动哺乳动物视网膜中视杆细胞和视锥细胞的分化、成熟和维持。该蛋白包含一个高度保守的同源域，介导序列特异性 DNA 结合；此外，它还包含多个转录激活结构域，这些结构域能够募集共调控因子至光感受器启动子和增强子区域，使 CRX 能够作为控制光感受器特性的转录因子网络中的核心节点发挥作用。CRX 是视网膜发育过程中最早表达的光感受器富集转录因子之一，它能够结合基因组中数千个位点。染色质免疫沉淀结合功能分析表明，这些位点中的一部分对应于关键光转导基因的调控元件，包括视蛋白、转导蛋白、阻遏蛋白和突触带的组成成分。在这些基因中，CRX 的结合对于高水平的、细胞类型特异性的转录是必需的。在许多感光细胞基因启动子处，CRX 与视杆细胞和视锥细胞的决定因子（如 NRL、NR2E3、RORβ 和 RXRγ）协同作用，形成细胞类型特异性复合物。在这些复合物中，先导因子和核受体与 CRX 协同作用，精细调控视杆细胞和视锥细胞特异性程序的表达，并维持成熟视网膜的亚型特性。对 CRX 结合和转录输出的全基因组分析表明，CRX 在发育过程中加速感光细胞调控元件处的染色质开放，增加增强子和启动子的可及性，随后这些区域获得活性组蛋白修饰。这表明 CRX 在分化感光细胞中协调表观遗传重塑和转录激活方面发挥着重要作用。对人类CRX同源域的结构和生化研究表明，疾病相关的错义突变会改变其DNA结合亲和力、特异性或转录激活能力，且患者来源的突变集中在对同源域结构和辅助因子相互作用至关重要的区域，这为与CRX变异相关的视网膜营养不良提供了机制解释。在Crx功能缺失的小鼠模型中，感光细胞无法正常表达视蛋白和其他光转导成分，表现出外节形成和突触带组装缺陷，并发生进行性退化，这证实了CRX依赖性转录对于感光细胞的初始分化以及长期存活和功能都至关重要。这些发现共同表明，CRX 是一种 Otx 样同源框转录因子，其结构化的同源域可识别光感受器顺式元件，其与 NRL、RORβ、NR2E3 和相关调节因子的相互作用定义了视杆细胞和视锥细胞的转录回路，其活性驱动染色质可及性、光转导基因表达和突触前活性区组织，从而将 CRX 确立为视网膜发育和遗传性光感受器退化研究的关键靶点。 |
| 参考文献 |
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