CTLA-4 Antibody (Rabbit mAb) [N24K13]
目录号: F9693
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 293T, Lane 2: 293T (hCTLA4 transfected)
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC, IF |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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25 kDa
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| 阳性对照 | Mouse thymus tissue; Mouse spleen tissue; Human colon carcinoma tissue; Human T‑cell lymphoma tissue; Human urothelial carcinoma tissue; Human esophageal adenocarcinoma tissue; Human tonsil tissue; Normal human thymus tissue |
|---|---|
| 阴性对照 | A172 cells; 293T cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| CTLA-4 Antibody (Rabbit mAb) [N24K13] 可检测内源性 CTLA-4 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| P16410 |
| 克隆号 |
|---|
| N24K13 |
| 别名 |
|---|
| activation-inducible lymphocyte immunomediatory molecule; AILIM; ALPS5; CD; CD152; CD278; celiac disease 3; CELIAC3; CTLA-4; CTLA4; GRD4; GSE; ICOS; IDDM12; MGC39850 |
| 背景 |
|---|
| CTLA-4 (CD152) 是一种免疫球蛋白超家族受体，表达于活化的常规T细胞，并在FoxP3⁺调节性T细胞上高水平组成型表达。在调节性T细胞上，CTLA-4作为显性负性检查点发挥作用，通过平衡CD28信号来限制共刺激并维持外周耐受。CTLA-4的胞外结构域与CD28具有结构同源性，并结合相同的配体CD80和CD86，但其亲和力和亲合力更高。这使得CTLA-4能够在免疫突触处与CD28竞争有限的B7分子，并通过跨内吞作用将其从抗原呈递细胞中移除，从而降低B7的密度并进一步减弱T细胞的共刺激。短的胞质尾缺乏内在的酶活性，但含有酪氨酸基序和富含赖氨酸的区域，可募集信号传导和运输伙伴：磷酸化依赖性地与网格蛋白衔接蛋白 AP-2 和其他内吞机制结合，使大部分 CTLA-4 保持在细胞内囊泡中；配体结合驱动其在突触处快速积累；与 SHP-2 和 PP2A 等磷酸酶的相互作用通过使激活级联的关键成分去磷酸化来减弱近端 TCR 和 CD28 信号传导。调节性T细胞利用CTLA-4通过耗竭树突状细胞上的CD80/CD86并改变其细胞因子谱，对邻近T细胞施加外源性抑制；而效应T细胞则依赖诱导的CTLA-4在抗原刺激后终止自身增殖。小鼠和人类中CTLA-4的种系或功能性缺失会导致CD28驱动的T细胞不受控制的激活、严重的淋巴细胞增殖、多器官浸润以及早期死亡或全身免疫失调综合征，这表明CTLA-4是自身反应性T细胞不可或缺的抑制机制。CTLA4基因位点的遗传变异与多种自身免疫性疾病相关，包括1型糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病、乳糜泻和系统性红斑狼疮，这与CTLA-4表达或功能的轻微降低导致自身反应性增强的机制相一致。在肿瘤微环境中，效应 T 细胞和调节性 T 细胞上的 CTLA-4 会导致 T 细胞功能障碍和对肿瘤抗原的耐受性，而抗体介导的 CTLA-4 阻断可以恢复共刺激，扩增肿瘤反应性克隆，并消耗肿瘤内 Treg 细胞，从而在部分患者中导致持久的肿瘤消退，但也会引起与免疫相关的不良事件，这反映了该通路在耐受性中的核心作用。 |
| 参考文献 |
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