Cullin 4B/CUL-4B Antibody (Rabbit mAb) [J23G17]
目录号: F7048
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: 293T, Lane 3: 3T3, Lane 4: PC-12
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP, IHC, IF, FCM |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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104 kDa
104 kDa,36 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Mouse testis tissue; Human breast carcinoma tissue; Rat testis tissue; Human testis tissue; Mouse breast cancer tissue; Mouse liver tissue; HeLa cells; 293T cells; NIH/3T3 cells; PC-12 cells; A375 cells; HEK-293 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Cullin 4B/CUL-4B Antibody (Rabbit mAb) [J23G17] 可检测内源性 Cullin 4B/CUL-4B 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q13620 |
| 克隆号 |
|---|
| J23G17 |
| 别名 |
|---|
| KIAA0695, Cullin-4B, CUL-4B |
| 背景 |
|---|
| CUL4B 是一种 cullin 家族支架蛋白，构成 CUL4B-RING E3 泛素连接酶复合物的核心，并组织模块化的 CRL4B 组装体，催化特定细胞周期、染色质和信号通路调节因子的多聚泛素化和蛋白酶体降解。该蛋白与 CUL4A 具有高度序列相似性，但其 N 端延伸区域包含核定位信号，支持其主要定位于细胞核内；其 C 端 cullin 结构域结合 RING 指蛋白 RBX1；衔接蛋白 DDB1 将 CUL4B 与一组不同的 DCAF 底物受体连接起来，赋予其靶标特异性。 CRL4B复合物利用DCAF衔接蛋白（如Cdt2、AMBRA1、DDB2、TRPC4AP和DCAF12）识别底物，包括CDT1、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白D亚型、p21、组蛋白H2A、H3和H4以及特定的线粒体或信号蛋白。CUL4B作为刚性支架，定位结合的底物和E2-泛素缀合物，促进Lys48连接的多聚泛素化和随后的蛋白酶体降解。核内CRL4B-DDB1-DDB2复合物靶向紫外线损伤的染色质，并在DNA损伤位点对组蛋白H2A和其他染色质成分进行单泛素化修饰。这些功能有助于核苷酸切除修复、通过CDT1周转进行复制许可控制以及维持基因组稳定性。 CUL4B还通过与mTOR组分MLST8相互作用以及蛋白酶体依赖性泛素化事件来调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1 (mTORC1)通路，从而将CRL4B活性与细胞生长、大小和代谢的控制联系起来。在G1-S期进程中，DCX(AMBRA1)CRL4B复合物泛素化CRL5复合物中的磷酸化细胞周期蛋白D家族蛋白和Elongin C，CUL4B与CUL4A共同参与细胞周期蛋白E的泛素化，从而塑造细胞周期蛋白-CDK活性谱，并确保G1期持续时间和S期进入。包含TRPC4AP或DCAF12的CRL4B复合物在DesCEND通路中发挥作用，识别底物C端降解信号以触发其降解，从而将CUL4B的功能扩展到C端质量控制和特定调控蛋白的周转。在免疫细胞中，CUL4B-RING E3连接酶通过控制转录因子和信号中间体的稳定性来调节CD4⁺ T细胞和其他亚群的分化和效应功能，而CRL4B活性与细胞因子产生、Toll样受体信号传导以及免疫稳态的维持密切相关。CUL4B的致癌作用包括在结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌和其他癌症中过度表达和扩增，在这些癌症中，CRL4B复合物通过多种机制促进细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化，这些机制包括p53信号通路的失活、Wnt/β-catenin通路的激活以及与含组蛋白去乙酰化酶的共抑制复合物的协同作用。在结直肠癌中，CUL4B通过与MDM2相互作用，降低p53的半衰期，并减少p53下游靶点（如p21和PUMA）的表达水平，从而抑制p53的表达，进而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和进展。在乳腺癌中，CUL4B与MTA1/NuRD、SIN3A、CoREST和NCoR/SMRT复合物结合，共同占据E-钙黏蛋白和AXIN2的启动子区域，并与Snail和ZEB2等转录因子协同作用，抑制上皮基因的表达，增强缺氧条件下的EMT信号通路，并促进癌症干细胞样特性；HIF-1α直接激活CUL4B的转录，而ERα-GATA3则抑制CUL4B的转录，使得CUL4B在肿瘤进展过程中受到缺氧和激素通路的调控。在发育、免疫和致癌背景下，CUL4B 发挥着核内 cullin 支架的作用，组装基于 DDB1 和 DCAF 的 CRL4B E3 连接酶，将 DNA 复制因子、细胞周期蛋白、组蛋白、信号蛋白和转录抑制因子的底物特异性泛素化与细胞周期控制、染色质重塑、DNA 修复、mTOR 信号传导、免疫分化和肿瘤发生联系起来。 |
| 参考文献 |
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