CXCR4 Antibody (Rabbit mAb) [N1P5]
目录号: F7902
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Ramos
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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40 kDa
43 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Jurkat cells; HEK293 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| CXCR4 Antibody (Rabbit mAb) [N1P5] 可检测内源性 CXCR4 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞连接，细胞膜，内体，溶酶体，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| P61073 |
| 克隆号 |
|---|
| N1P5 |
| 别名 |
|---|
| CD184, C-X-C chemokine receptor type 4, CXC-R4, CXCR-4, FB22, Fusin, HM89, LCR1, NPYRL, Stromal cell-derived factor 1 receptor, LESTR, LAP-3, LPS-associated protein 3, SDF-1 receptor, CXCR4 |
| 背景 |
|---|
| C-X-C趋化因子受体4型（CXCR4，又称CD184）是一种七次跨膜G蛋白偶联受体，特异性识别趋化因子CXCL12/SDF-1，既是白细胞迁移的关键调节因子，也是嗜T细胞HIV-1毒株入侵的辅助受体。CXCR4具有典型的GPCR结构，包含一个由七个α螺旋组成的跨膜束，胞外N端和环状区域构成趋化因子和病毒包膜的结合位点，胞内环状区域和C端尾部与异源三聚体G蛋白及下游信号通路偶联。 CXCL12 与 CXCR4 的结合会引发构象变化，进而激活 G 蛋白，并激活包括 PI3K/AKT、ERK/MAPK 和小 GTP 酶在内的信号级联反应，最终导致细胞骨架重组、趋化性、细胞存活和血管生成反应；CXCL12–CXCR4 信号传导对于造血干细胞在骨髓中的归巢和滞留、B 细胞在淋巴器官中的定位和运输，以及在发育和成年神经发生过程中引导新生成的神经元至关重要。结构和突变分析表明，N端结构域中的酸性和芳香族残基（Asp20、Tyr21）以及胞外环3中的酸性残基（Glu268）对于趋化因子结合至关重要，而胞外环2中的Tyr190则对信号转导必不可少。此外，相同的N端和胞外环区域参与识别HIV-1 gp120以及辅助受体功能，这些片段处于趋化因子和病毒相互作用的核心。CXCR4还能识别其他配体，例如由人疱疹病毒8编码的拮抗性趋化因子vMIP-II，并能结合泛素和巨噬细胞迁移抑制因子（MIF），从而扩展其配体库，并将炎症和损伤相关信号整合到CXCR4依赖性通路中。在HIV发病机制中，CXCR4与CD4协同作用，促进T嗜性病毒株的入侵；SDF-1α或vMIP-II与CXCR4的结合可抑制HIV-1通过该辅助受体的入侵，这为趋化因子介导的抗病毒作用提供了机制基础，并为CXCR4拮抗剂（如阻断gp120结合的小分子和肽类药物）的结构导向设计提供了指导。CXCR4-CXCL12信号通路支持祖细胞归巢和滞留、细胞停滞和存活，以及缺血和炎症环境下的新生血管形成；使用普乐沙福等药物阻断CXCR4可动员造血干细胞进入外周血用于移植，并已被探索作为一种破坏肿瘤-基质相互作用、限制转移扩散至富含CXCL12的器官（包括骨髓、肺和肝脏）的策略。 CXCR4 表达失调发生在二十多种实体瘤和血液肿瘤中，其中高受体水平与向 CXCL12 梯度迁移增加、血管生成增强和预后不良相关，而 CXCR4 的种系功能获得性突变是 WHIM 综合征的病因，WHIM 综合征是一种原发性免疫缺陷，其特征是疣、低丙种球蛋白血症、感染和骨髓滞留，这是由于白细胞迁移受损和 B 细胞发育异常所致。 |
| 参考文献 |
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