Cyclin A1 + A2 Antibody (Rabbit mAb) [N12H18]
目录号: F2458
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: HepG2
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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52 kDa
52 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human colon cancer tissue; Human testis tissue; Recombinant Human Cyclin A1 fragment; Full-length Human Cyclin A2 recombinant protein; HeLa cells; K562 cells; HepG2 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| Cyclin A1 + A2 Antibody (Rabbit mAb) [N12H18] 可检测内源性 Cyclin A1 + A2 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞核，细胞质 |
| Uniprot ID |
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| P78396, P20248 |
| 克隆号 |
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| N12H18 |
| 别名 |
|---|
| Cyclin-A1 | CCNA1 | CCN1 | CCNA | CCNA2 | Cyclin-A2 | Cyclin-A | Cyclin A |
| 背景 |
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| 细胞周期蛋白A1和细胞周期蛋白A2是A型细胞周期蛋白，它们是细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的调节亚基，共同协调生殖细胞减数分裂和体细胞有丝分裂的关键转换。细胞周期蛋白A1在雄性生殖细胞中表达受限，而细胞周期蛋白A2在增殖的体细胞组织中广泛表达。两种蛋白都具有特征性的细胞周期蛋白盒折叠结构，该结构提供了与CDK结合的界面，但它们的表达时间和结合伴侣不同：细胞周期蛋白A1在粗线期晚期和双线期精母细胞中与Cdk2和Cdk1结合，并在第一次减数分裂前后出现；而细胞周期蛋白A2在精原细胞和细线期前精母细胞中含量丰富，主要与生殖细胞中的Cdk2结合，这反映了它们在减数分裂起始和减数分裂过程中不同的功能。在雄性减数分裂过程中，细胞周期蛋白A1是细胞从G2期进入减数分裂I中期所必需的；靶向破坏 Ccna1 基因会导致精子发生停滞在减数分裂 I 期之前，Cdc2 激酶激活缺陷，尽管保留了 B 型细胞周期蛋白，但无法产生活性 M 期促进因子，并且细胞周期蛋白 A1–Cdc2/Cdk2 复合物可以磷酸化 Cdc25A 和 Cdc25C 磷酸酶，表明细胞周期蛋白 A1 参与了一个放大环路，该环路驱动 MPF 激活和精母细胞中的 G2/M 期转换。睾丸免疫定位研究表明，细胞周期蛋白 A1 蛋白在第一次减数分裂之前或期间出现在生殖细胞中，然后消失；而细胞周期蛋白 A2 在进入减数分裂途径的精原细胞和前细线期精母细胞中表达较早；在生殖细胞裂解液中可以检测到细胞周期蛋白 A1 依赖性激酶对组蛋白 H1 的活性，这支持了细胞周期蛋白 A1-CDK 复合物在染色质凝聚和减数分裂染色体分离中的作用。相比之下，细胞周期蛋白A2在体细胞S期开始时合成，并与Cdk2结合，通过磷酸化CDC6和MCM蛋白等许可因子来启动和维持DNA复制并防止重复复制。随后，A2与Cdk1结合，促进G2/M期进程，并触发细胞周期蛋白B1-Cdk1复合物的激活，进而驱动染色质凝聚和核膜破裂。这使得细胞周期蛋白A2成为有丝分裂周期中G1/S期和G2/M期转换的关键调控因子。在小鼠发育和早期胚胎发生过程中，细胞周期蛋白A2在分裂细胞中普遍表达，并控制DNA复制和纺锤体组装；而细胞周期蛋白A1的表达则局限于精母细胞、白血病细胞和某些有丝分裂后多纤毛细胞。这表明，它们不同的表达模式和CDK伴侣的使用决定了A型细胞周期蛋白在生殖细胞周期和体细胞周期中的功能特化。遗传学和功能研究表明，细胞周期蛋白A1对男性生育能力至关重要，细胞周期蛋白A1单倍体不足会导致精子数量和质量下降；而细胞周期蛋白A2敲除则会导致胚胎致死，因为有丝分裂增殖失败。这强调了细胞周期蛋白A1是减数分裂的关键调控因子，而细胞周期蛋白A2对于一般的细胞分裂是不可或缺的。细胞周期蛋白A1和A2均与肿瘤生物学密切相关：细胞周期蛋白A2在多种癌症中经常过表达，其高表达水平与不良预后相关，并可能通过改变S期和G2/M期调控而导致基因组不稳定；细胞周期蛋白A1在某些白血病和实体瘤中表达，反映了恶性肿瘤中生殖系细胞周期调控因子的失调。 A 型细胞周期蛋白 A1 和 A2 构成了一对结构相关的 CDK 伙伴，它们不同的表达域和激酶相互作用协调减数分裂和有丝分裂中的 G1/S 和 G2/M 转换，其中细胞周期蛋白 A1 驱动雄性生殖细胞中的 MPF 激活和第一次减数分裂，而细胞周期蛋白 A2 控制体细胞谱系中的 S 期进入、DNA 复制保真度和有丝分裂开始，这使得这对细胞周期蛋白成为研究细胞周期控制、配子发生和癌症的重要靶标。 |
| 参考文献 |
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