Cyclophilin B Antibody (Rabbit mAb) [F10F4]
目录号: F7231
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HepG2, Lane 2: Hela, Lane 3: A431, Lane 4: PC12
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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24 kDa
18 kDa, 24 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Mouse heart tissue; Rat heart tissue; HAP1 cells; U87-MG cells; HepG2 cells; HeLa cells; A431 cells; NIH/3T3 cells; PC-12 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | Jurkat cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Cyclophilin B Antibody (Rabbit mAb) [F10F4] 可检测内源性 Cyclophilin B 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 内质网，线粒体 |
| Uniprot ID |
|---|
| P23284 |
| 克隆号 |
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| F10F4 |
| 别名 |
|---|
| CYPB, PPIB, Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B, PPIase B, CYP-S1, Cyclophilin B, Rotamase B, S-cyclophilin, SCYLP |
| 背景 |
|---|
| 环孢亲和素B是环孢亲和素家族的一种分泌途径肽基脯氨酰顺反异构酶，它在内质网中作为分子伴侣发挥作用，并在分泌后参与细胞外信号传导。该蛋白携带一个N端信号序列，该序列引导其在翻译过程中转运至内质网腔内，并在内质网腔内积累。环孢亲和素B通过催化新生和内质网驻留多肽中脯氨酸亚胺肽键的顺反异构化来辅助蛋白质折叠。环孢素A的结合会改变其在分泌途径中的转运。定位于内质网的环孢亲和素B在内质网和后续分泌区室之间分布，而环孢素A的结合会导致其滞留发生改变，进而影响其向高尔基体和细胞外空间的转运。这表明药物相互作用会调节环孢亲和素B与底物蛋白和分泌货物的结合。分泌部分可与细胞表面受体和基质成分结合；环孢亲和素B作为CD147受体的配体，与T淋巴细胞、粒细胞和巨噬细胞上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用，从而促进趋化作用、T细胞与纤连蛋白的黏附以及下游事件的调控，例如丝裂原活化蛋白激酶的激活、钙离子转运和促凋亡蛋白Bim的表达。这种内质网分子伴侣活性和细胞外受体结合的结合，使环孢亲和素B参与连接蛋白质折叠稳态、炎症信号传导和细胞迁移的通路，其在炎症刺激和氧化应激下的分泌可促进组织或全身炎症，但其自身并不直接诱导促炎细胞因子的产生。其结构特征包括保守的环孢亲和素PPIase结构域，该结构域为脯氨酸异构化提供活性位点；此外，还包括支持与细胞表面CD147和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的区域，使得同一多肽能够在折叠和信号传导环境中发挥作用。在脂肪生成和骨细胞生物学中，环孢亲和素B被描述为一种分子伴侣，它通过调节AKT/mTOR或JAK2/STAT3等信号级联来促进分化，将其PPIase活性和受体相互作用与前脂肪细胞和成骨细胞样细胞中谱系特异性基因的转录调控联系起来。在炎症和代谢应激（包括代谢综合征）下，血清和组织中环孢亲和素B的水平升高，其组成性分泌与代谢综合征的患病率和严重程度相关，这表明其在代谢性炎症中发挥作用，其机制是通过参与细胞间通讯和白细胞迁移，而非直接诱导细胞因子。在病毒感染中，环孢亲和素B作为丙型肝炎病毒复制的宿主因子，通过结合病毒RNA聚合酶NS5B，刺激其RNA结合活性，从而支持高效的基因组复制。RNA干扰介导的环孢亲和素B表达降低或NS5B-环孢亲和素B相互作用的破坏会降低病毒复制效率，这表明该PPIase是丙型肝炎病毒复制机制中的一个调节因子。环孢亲和素B在多种肿瘤类型和炎症性疾病（如类风湿性关节炎和银屑病）中表达上调，其通过CD147和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖发挥的细胞外活性，促进免疫细胞的趋化性、黏附和信号传导，使其处于蛋白质折叠质量控制、病毒复制、代谢和炎症信号传导以及肿瘤进展的交汇点，可通过基因操作和靶向环孢亲和素-配体相互作用的药物抑制进行调控。 |
| 参考文献 |
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