CYP7B1 Antibody (Rabbit mAb) [M6P12]

目录号: F3601

抗体应用：反应性：Human

Lane 1: PC-3, Lane 2: A431

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

操作要点

WB
建议曝光 60s 以上。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 - 1:10000

抗体应用
WB

反应性
Human

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量实际分子量
58 kDa 55 kDa
^*为什么预测分子量和实际分子量会有不同？以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。

阳性对照	Human fetal liver; Human fetal kidney; PC3 cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
CYP7B1 Antibody (Rabbit mAb) [M6P12] 可检测内源性 CYP7B1 总蛋白水平。

蛋白定位
内质网，内膜系统，微粒体

Uniprot ID
O75881

克隆号
M6P12

别名
Cytochrome P450 7B1, 24-hydroxycholesterol 7-alpha-hydroxylase, 25/26-hydroxycholesterol 7-alpha-hydroxylase, 3-hydroxysteroid 7-alpha hydroxylase, Oxysterol 7-alpha-hydroxylase, CYP7B1

背景
CYP7B1 是一种微粒体细胞色素 P450 单加氧酶，可作为氧固醇和类固醇 7α-羟化酶，催化 NADPH 依赖的氧插入到各种胆固醇衍生底物的 7α（在某些情况下是 6α）位置，从而将氧固醇、神经类固醇和胆汁酸代谢联系起来。该酶在肝脏和多种类固醇生成或类固醇反应组织（包括脑、睾丸、卵巢、前列腺、肾脏和肠道）中表达，在这些组织中，它羟基化氧固醇，例如 25-羟基胆固醇、27-羟基胆固醇和胆甾-5-烯-3β,25-二醇，以及神经甾醇，例如脱氢表雄酮和孕烯醇酮。其结构要求包括 3β-羟基、C17 位的极性取代基以及 C20-C24 位之外没有其他侧链羟基。在肝外组织中，CYP7B1 通过将氧固醇转化为 7α-羟基衍生物来启动胆固醇分解代谢途径，这些衍生物可以运输到肝脏并进一步代谢为胆汁酸，从而提供了一种与经典的 CYP7A1 依赖性途径互补的“替代”胆汁酸合成途径；在免疫系统中，CYP7B1 的产物 7α,25-二羟基胆固醇作为趋化受体 GPR183/EBI2 的高亲和力配体，引导 B 细胞在生发中心定位，从而将 CYP7B1 的活性与体液免疫结构直接联系起来。在大脑中，CYP7B1 羟基化神经活性类固醇和氧固醇，通过核受体调节它们的信号传导，并有助于维持胆固醇和神经类固醇的平衡。Cyp7b1 基因敲除小鼠的肝脏和大脑中氧固醇 7α-羟基化作用丧失，同时多种氧固醇的水平也发生改变，表明该酶是体内这些底物的主要 7α-羟化酶。人类 CYP7B1 功能丧失突变导致常染色体隐性遗传性痉挛性截瘫 5 型，生化研究记录了 25-和 27-羟基胆固醇及相关胆甾酸的积累，临床队列显示纯粹和复杂的痉挛性截瘫表型，伴有不同程度的白质变化，支持 CYP7B1 介导的氧固醇解毒受损、胆汁酸和神经甾体代谢紊乱以及长束运动神经元变性之间的致病联系。

背景

CYP7B1 是一种微粒体细胞色素 P450 单加氧酶，可作为氧固醇和类固醇 7α-羟化酶，催化 NADPH 依赖的氧插入到各种胆固醇衍生底物的 7α（在某些情况下是 6α）位置，从而将氧固醇、神经类固醇和胆汁酸代谢联系起来。该酶在肝脏和多种类固醇生成或类固醇反应组织（包括脑、睾丸、卵巢、前列腺、肾脏和肠道）中表达，在这些组织中，它羟基化氧固醇，例如 25-羟基胆固醇、27-羟基胆固醇和胆甾-5-烯-3β,25-二醇，以及神经甾醇，例如脱氢表雄酮和孕烯醇酮。其结构要求包括 3β-羟基、C17 位的极性取代基以及 C20-C24 位之外没有其他侧链羟基。在肝外组织中，CYP7B1 通过将氧固醇转化为 7α-羟基衍生物来启动胆固醇分解代谢途径，这些衍生物可以运输到肝脏并进一步代谢为胆汁酸，从而提供了一种与经典的 CYP7A1 依赖性途径互补的“替代”胆汁酸合成途径；在免疫系统中，CYP7B1 的产物 7α,25-二羟基胆固醇作为趋化受体 GPR183/EBI2 的高亲和力配体，引导 B 细胞在生发中心定位，从而将 CYP7B1 的活性与体液免疫结构直接联系起来。在大脑中，CYP7B1 羟基化神经活性类固醇和氧固醇，通过核受体调节它们的信号传导，并有助于维持胆固醇和神经类固醇的平衡。Cyp7b1 基因敲除小鼠的肝脏和大脑中氧固醇 7α-羟基化作用丧失，同时多种氧固醇的水平也发生改变，表明该酶是体内这些底物的主要 7α-羟化酶。人类 CYP7B1 功能丧失突变导致常染色体隐性遗传性痉挛性截瘫 5 型，生化研究记录了 25-和 27-羟基胆固醇及相关胆甾酸的积累，临床队列显示纯粹和复杂的痉挛性截瘫表型，伴有不同程度的白质变化，支持 CYP7B1 介导的氧固醇解毒受损、胆汁酸和神经甾体代谢紊乱以及长束运动神经元变性之间的致病联系。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19687010/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24491228/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%