DCAMKL1 Antibody (Rabbit mAb) [P14A13]
目录号: F6849
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Mouse brain, Lane 2: Rat brain
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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82 kDa
82 kDa,47 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Rat colon tissue; Mouse stomach tissue; Mouse brain tissue; Rat brain tissue; Mouse cerebellum tissue; Rat cerebellum tissue; Mouse colon tissue; SH-SY5Y cells; Wild-type HAP1 cells; NIH/3T3 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| DCAMKL1 Antibody (Rabbit mAb) [P14A13] 可检测内源性 DCAMKL1 总蛋白水平。 |
| Uniprot ID |
|---|
| O15075 |
| 克隆号 |
|---|
| P14A13 |
| 别名 |
|---|
| DCAMKL1, DCDC3A, KIAA0369, DCLK1, Serine/threonine-protein kinase DCLK1, Doublecortin domain-containing protein 3A, Doublecortin-like and CAM kinase-like 1, Doublecortin-like kinase 1 |
| 背景 |
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| 双皮质素样激酶1 (DCAMKL1/DCLK1/KIAA0369) 是一种在大脑中富集的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其N端包含一个双皮质素同源区，C端包含一个钙离子/钙调蛋白依赖性激酶样结构域，使其在神经元发育过程中处于微管调控和钙敏感信号转导的交汇点。其N端片段约有三分之二与双皮质素 (DCX) 相似，DCX是一种微管相关蛋白，是神经元迁移所必需的。DCAMKL1在中枢和周围神经系统的迁移神经元群体中均有表达，其表达与DCX和微管的表达重叠，这与其在皮层和海马层状结构形成过程中调控细胞骨架动力学的作用相符。纯化的DCAMKL1可直接与微管结合，并刺激纯化微管蛋白的聚合，形成星状微管结构。在细胞系和原代神经细胞中过表达DCAMKL1会导致显著的微管束集，而延时成像显示束集的微管仍保持动态状态，表明DCAMKL1作为一种微管相关调节因子，能够增强微管的聚合和组织，但并不刚性地稳定晶格。其C端激酶结构域编码一种功能性蛋白激酶，能够磷酸化髓鞘碱性蛋白并发生自身磷酸化。与Ca²⁺/钙调蛋白依赖性激酶的序列相似性，以及其定位和表达模式，支持其参与Ca²⁺调节的信号通路，将微管行为与细胞内信号相偶联。然而，即使激酶功能被消除，微管聚合活性仍然存在，这表明DCAMKL1的结构和催化作用是分离的。基因组分析发现 DCAMKL1 是位于人类 13q13-q14 染色体上的 DCX 同源物，主要在人类胎儿脑中作为主要转录本表达；Northern 印迹和免疫组织化学数据显示，在小鼠胚胎发生过程中以及包括大脑皮层、海马和杏仁核在内的成年脑区中，多种转录本异构体差异表达，这表明 DCAMKL1 基因的选择性剪接产生了相关蛋白质，这些蛋白质调节发育和成熟神经系统中 DCAMKL1 控制的神经元可塑性的重叠方面。 |
| 参考文献 |
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