DMT1/SLC11A2 Antibody (Rabbit mAb) [C16J1]
目录号: F5070
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Caco-2, Lane 2: Huh7, Lane 3: 293T, Lane 4: SH-SY5Y
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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62 kDa
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| 阳性对照 | SK-MEL-5 cells; SK-MEL-2 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| DMT1/SLC11A2 Antibody (Rabbit mAb) [C16J1] 可检测内源性 DMT1/SLC11A2 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，内体，高尔基体，溶酶体，内膜系统，线粒体 |
| Uniprot ID |
|---|
| P49281 |
| 克隆号 |
|---|
| C16J1 |
| 别名 |
|---|
| Natural resistance-associated macrophage protein 2, NRAMP 2, Divalent cation transporter 1, Divalent metal transporter 1 (DMT-1), Solute carrier family 11 member 2, SLC11A2, DCT1, DMT1, NRAMP2 |
| 背景 |
|---|
| DMT1 (SLC11A2/NRAMP2) 是 SLC11 家族中的一种质子偶联二价金属转运蛋白，它为非血红素铁进入肠细胞以及转铁蛋白衍生的铁从红系前体细胞和其他细胞的内体排出提供了主要途径，从而将管腔、内体和胞质中的铁池与全身铁稳态和细胞内金属平衡联系起来。这种多跨膜转运蛋白具有多个跨膜螺旋，这些螺旋形成底物转运通道，并将 Fe²⁺ 和其他二价阳离子的内向转运与质子梯度偶联。它在十二指肠肠细胞的顶端刷状缘膜上发挥作用，将膳食来源释放的 Fe²⁺ 转运至细胞内；在成红细胞的内体膜上发挥作用，将 Fe²⁺ 从酸化的含转铁蛋白的内体转运至胞质，用于血红素合成。 DMT1 的四种主要亚型源于启动子选择性使用和 3′ UTR 剪接，它们在 N 端序列以及 3′ UTR 中是否存在铁反应元件 (IRE) 方面存在差异；这些亚型在组织和亚细胞中分布各异，并受全身铁状态的差异性调控，这种调控通过 HIF2α 依赖性转录和 IRE/IRP 介导的转录后调控实现，使得 DMT1 的表达在缺铁时增加，在铁储备充足时减少。在功能上，DMT1 对二价阳离子具有选择性，并以高亲和力转运 Fe²⁺，但也介导 Mn²⁺、Co²⁺、Cd²⁺ 和其他金属的摄取，这使其不仅在生理性铁吸收和红细胞生成中发挥核心作用，而且在锰的代谢以及环境或治疗暴露下有毒金属的潜在积累中也起着重要作用。 SLC11A2基因的双等位基因功能缺失突变会导致一种极其罕见的低色素性小细胞性贫血伴铁过载（AHMIO1）。该病中，成红细胞中DMT1活性受损，导致内体向胞质的铁转运减少，尽管血清铁水平很高，但仍出现铁限制性红细胞生成。与此同时，肠道DMT1的代偿性上调和持续的铁吸收促进肝脏铁过载，最终导致血清铁水平反常升高，并伴有肝功能障碍。错义突变，例如G75R和N491S，会损害DMT1的转运和稳定性，导致其错误定位至溶酶体，降低患者淋巴母细胞中转运蛋白的水平，并减少Fe²⁺的转运。临床报告显示，重组促红细胞生成素可以改善贫血表型，并可能有助于动员此类患者的肝脏铁。因此，SLC11A2是导致贫血和铁过载的机制性遗传病因之一。在神经系统中，DMT1 表达在黑质的多巴胺能神经元中被检测到，含 IRE 的亚型 (DMT1+IRE) 在基于毒素的帕金森病模型和死后帕金森病黑质中上调，其中 DMT1 的增加与黑质铁含量升高、Fe²⁺ 摄取增强、活性氧生成和氧化应激相关；铁螯合可减弱这些影响，支持 DMT1 介导的铁积累在黑质神经退行性变中的致病作用。 |
| 参考文献 |
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