DnaK Antibody [E21A24]

目录号: F2197

抗体应用：反应性：Escherichia coli

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:2000

抗体应用
WB

反应性
Escherichia coli

抗体类型
Mouse Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量实际分子量
70 kDa 70 kDa
^*为什么预测分子量和实际分子量会有不同？以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
DnaK Antibody [E21A24] 可检测内源性 DnaK 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞内膜，细胞膜，细胞质，内膜系统

Uniprot ID
P0A6Y8

克隆号
E21A24

别名
groP; grpF; seg; b0014; JW0013; dnaK; Chaperone protein DnaK; HSP70; Heat shock 70 kDa protein; Heat shock protein 70

背景
DnaK是一种高度保守的细菌热休克蛋白，属于HSP70家族，主要在大肠杆菌中进行研究。它作为分子伴侣，在蛋白质折叠、变性蛋白质的复性以及应激条件下的蛋白质稳态维持中发挥着至关重要的作用。DnaK由两个主要结构域组成：一个44 kDa的N端核苷酸结合结构域（NBD），负责ATP的结合和水解；以及一个25 kDa的C端底物结合结构域（SBD），其中包含一个β-三明治亚结构域，该亚结构域通过暴露的疏水区域结合未折叠的蛋白质底物。DnaK通过ATP依赖性循环发挥作用：ATP结合诱导其形成开放构象，从而释放底物；而ATP水解则触发其形成封闭构象，从而实现对底物的高亲和力结合。 DnaK在ATP结合状态下形成瞬时二聚体，增强其与辅助伴侣蛋白DnaJ（Hsp40）的相互作用，从而促进底物的有效识别和递送。辅助伴侣蛋白GrpE作为核苷酸交换因子，加速ADP的释放，使DnaK重置以进行下一个循环。DnaK有助于防止细胞应激期间的蛋白质聚集，并通过与辅助伴侣蛋白DnaJ和其他伴侣蛋白的相互作用参与DNA复制等关键过程。该伴侣蛋白网络对于细胞在热休克和其他蛋白毒性应激下的存活至关重要，维持着蛋白质质量控制和细胞稳态。

背景

DnaK是一种高度保守的细菌热休克蛋白，属于HSP70家族，主要在大肠杆菌中进行研究。它作为分子伴侣，在蛋白质折叠、变性蛋白质的复性以及应激条件下的蛋白质稳态维持中发挥着至关重要的作用。DnaK由两个主要结构域组成：一个44 kDa的N端核苷酸结合结构域（NBD），负责ATP的结合和水解；以及一个25 kDa的C端底物结合结构域（SBD），其中包含一个β-三明治亚结构域，该亚结构域通过暴露的疏水区域结合未折叠的蛋白质底物。DnaK通过ATP依赖性循环发挥作用：ATP结合诱导其形成开放构象，从而释放底物；而ATP水解则触发其形成封闭构象，从而实现对底物的高亲和力结合。 DnaK在ATP结合状态下形成瞬时二聚体，增强其与辅助伴侣蛋白DnaJ（Hsp40）的相互作用，从而促进底物的有效识别和递送。辅助伴侣蛋白GrpE作为核苷酸交换因子，加速ADP的释放，使DnaK重置以进行下一个循环。DnaK有助于防止细胞应激期间的蛋白质聚集，并通过与辅助伴侣蛋白DnaJ和其他伴侣蛋白的相互作用参与DNA复制等关键过程。该伴侣蛋白网络对于细胞在热休克和其他蛋白毒性应激下的存活至关重要，维持着蛋白质质量控制和细胞稳态。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25635056/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38110031/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%