Erk5 Antibody (Rabbit mAb) [P11L5]
目录号: F7770
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HeLa, Lane 2: NIH/3T3, Lane 3: PC-12
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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88 kDa
115 kDa, 88 kDa, 36 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | HeLa cells; A549 cells; NIH/3T3 cells; HAP1 cells; PC-12 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Erk5 Antibody (Rabbit mAb) [P11L5] 可检测内源性 Erk5 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q13164 |
| 克隆号 |
|---|
| P11L5 |
| 别名 |
|---|
| BMK1, ERK5, PRKM7, MAPK7, Mitogen-activated protein kinase 7, MAP kinase 7, MAPK 7, Big MAP kinase 1, Extracellular signal-regulated kinase 5, BMK-1, ERK-5 |
| 背景 |
|---|
| Erk5，又称大MAP激酶1或BMK1，由MAPK7基因编码，与ERK1/2、JNK和p38激酶同属丝裂原活化蛋白激酶家族。它作为三级MAPK级联反应的末端效应激酶发挥作用，该级联反应由上游激酶MEKK2和MEKK3、中间激酶MEK5以及ERK5自身构成。ERK5的N端激酶结构域与ERK2的序列同一性约为一半，但其结构与其他MAPK家族成员的区别在于其独特的C端延伸区，该延伸区包含核定位信号和转录激活结构域，赋予ERK5双重身份：既是具有催化活性的激酶，又是直接的转录激活因子。在促分裂原或细胞应激刺激下，MEK5磷酸化ERK5激活环内的TEY基序，激活激酶结构域。这种激活会触发ERK5 C端多个残基的自身磷酸化，进而驱动ERK5从胞质转位至细胞核。在细胞核内，ERK5与MEF2家族转录因子（包括MEF2D）相互作用并激活它们。进入细胞核后，ERK5通过两种作用于同一底物的机制不同的途径激活转录：一是ERK5激酶结构域直接磷酸化MEF2；二是另一种独立的、不依赖于激酶活性的机制，其中C端转录激活结构域本身作为转录共激活因子发挥作用。这意味着ERK5的转录活性并非完全依赖于其催化活性。该转录程序驱动Kruppel样转录因子基因LKLF/KLF2的表达。尽管保留了激酶活性，但缺失C端转录激活结构域的截短型ERK5构建体的表达却无法支持内皮细胞和T细胞中LKLF的表达，这直接表明，转录激活结构域而非单独的激酶活性是该特定靶基因所必需的。由于LKLF/KLF2调控血管生成、T细胞静止状态和血管内皮稳态，且MEK5-ERK5构成一个独特的、非冗余的信号通路，没有其他上游激酶，因此，内皮细胞和T细胞中ERK5的缺失会导致细胞体积增大和活化标志物上调，这与静止状态的破坏相一致。 C端结构域还受ERK5自身以外的其他激酶调控，包括ERK1/2和CDK1。这些激酶能够独立于ERK5的催化活性磷酸化C端残基，这意味着ERK5驱动的转录整合了来自经典MEK5-ERK5轴之外的平行信号通路的输入。由于ERK5激酶抑制剂可能不影响C端转录激活结构域的完整性，并且在某些情况下反而会增加ERK5依赖性转录，因此在评估ERK5靶向疗法时，必须同时考虑激酶结构域和转录激活结构域。 |
| 参考文献 |
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