Fibulin 3 Antibody (Rabbit mAb) [G19N6]
目录号: F8393
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HUVEC
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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54 kDa
55 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human eye tissue; Human breast carcinoma tissue; Human ovary tissue; Human testis tissue; Human skeletal muscle tissue; Human colon tissue; Human colon carcinoma tissue; HUVEC cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Fibulin 3 Antibody (Rabbit mAb) [G19N6] 可检测内源性 Fibulin 3 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞外基质，细胞外环境 |
| Uniprot ID |
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| Q12805 |
| 克隆号 |
|---|
| G19N6 |
| 别名 |
|---|
| FBLN3, FBNL, EFEMP1, EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1, Extracellular protein S1-5, Fibrillin-like protein, Fibulin-3, FIBL-3 |
| 背景 |
|---|
| 纤连蛋白-3 (EFEMP1) 是一种分泌型、富含二硫键的细胞外基质糖蛋白，属于纤连蛋白家族，定位于视网膜、肺、血管和骨骼等组织的基底膜和细胞周围基质中。它有助于组织弹性基质和胶原基质，并以依赖于组织环境的方式调节细胞-基质黏附、生长因子信号传导和基质活化。该蛋白包含一个N端信号肽、一个短的独特片段、一系列串联的钙结合EGF样结构域以及一个C端纤连蛋白型模块，该模块介导其与包括纤连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白相关成分和ECM1在内的细胞外基质 (ECM) 伙伴的结合，使纤连蛋白-3能够参与支架组装并赋予基底膜生物力学稳定性。纤连蛋白-3促进整合素依赖性细胞黏附和铺展，并支持多种组织中的细胞-ECM连接。 EFEMP1 的存在影响弹性纤维的组织和交联以及基底膜的完整性。敲低 EFEMP1 会降低肿瘤细胞和基质细胞的黏附性，并改变细胞外基质 (ECM) 重塑基因的表达，表明 EFEMP1 在基质组成和刚度方面发挥着调控作用。在眼部，EFEMP1 由视网膜色素上皮和脉络膜组织表达，并参与布鲁赫膜的结构；疾病相关突变，例如 R345W，会导致 EFEMP1 错误折叠和分泌受损，进而导致突变型纤连蛋白-3 在细胞内和视网膜色素上皮下积聚，并引发黄斑营养不良。此外，年龄相关性黄斑变性 (AMD) 的基因表达谱分析显示，视网膜-脉络膜组织中 EFEMP1 表达上调，新生血管性 AMD 患者血清中纤连蛋白-3 水平升高，表明 EFEMP1 可作为脉络膜新生血管形成的生物标志物和潜在驱动因素。在癌症生物学中，纤连蛋白-3 作为一种基质细胞调节剂，具有组织和环境依赖性的促肿瘤和抗肿瘤作用；在骨肉瘤和其他实体瘤中，EFEMP1 的过表达与侵袭性增强、肺转移和基质重塑有关，在骨肉瘤模型中，EFEMP1 的缺失会降低肺成纤维细胞中 COL1A1、POSTN、MMP1 和 MMP2 等 ECM 基因的表达，增加 TIMP3，并减少肿瘤细胞与预处理基质的粘附，这表明纤连蛋白-3 通过重编程基质 ECM 沉积和蛋白酶平衡来塑造促转移的微环境。宫颈癌和其他上皮癌的机制研究进一步表明，纤连蛋白-3可诱导上皮-间质转化，激活PI3K-AKT-mTOR或Wnt/β-catenin通路，通过上调VEGF促进血管生成，并与低分化和不良预后相关。尽管在某些情况下也报道了其具有相反的抑癌作用，但这凸显了纤连蛋白-3作为一种精细调控的细胞外基质（ECM）相关信号通路调节因子的作用，而非一种单一的致癌结构蛋白。因此，在眼科和肿瘤系统中，纤连蛋白-3/EFEMP1作为ECM组织者和基质细胞信号枢纽发挥作用，其模块化的EGF样结构域和纤连蛋白结构域协调与ECM蛋白、整合素和生长因子通路的相互作用，从而维持组织结构，调控新生血管和转移程序，并产生疾病特异性的表达和分泌模式，这些模式正日益被探索作为诊断和治疗靶点。 |
| 参考文献 |
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