Filamin B Antibody (Rabbit mAb) [L9N6]
目录号: F9861
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: A-204, Lane 2: 293T, Lane 3: A375, Lane 4: HT-1080
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IHC, IF, FCM |
| 反应性 |
|---|
| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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278 kDa
315 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Mouse colon tissue; Rat colon tissue; Human skin tissue; Human colon tissue; Rat lung tissue; Mouse stomach tissue; HT-1080 cells; 293T cells; C2C12 cells; A-204 cells; HEK-293T cells; A375 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | Rat skeletal muscle tissue |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：250 mA, 180 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Filamin B Antibody (Rabbit mAb) [L9N6] 可检测内源性 Filamin B 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞骨架 |
| Uniprot ID |
|---|
| O75369 |
| 克隆号 |
|---|
| L9N6 |
| 别名 |
|---|
| FLN1L, FLN3, TABP, TAP, FLNB, Filamin-B, FLN-B, ABP-278, ABP-280 homolog, Actin-binding-like protein, Beta-filamin, Filamin homolog 1, Filamin-3, Thyroid autoantigen, Fh1, Truncated ABP |
| 背景 |
|---|
| 丝状蛋白B (FLNB) 是一种大型二聚体肌动蛋白结合蛋白，属于丝状蛋白家族，它能将F-肌动蛋白交联成三维网络，并将膜受体连接到细胞骨架，从而协调骨骼、血管和肌肉组织中的机械转导和信号传导。该蛋白包含一个N端肌动蛋白结合域，其后是一系列Ig样重复序列，形成柔性杆状片段；C端二聚化形成V形结构，能够进行正交肌动蛋白分支，并提供多个跨膜蛋白和信号因子的结合位点。通过这些结构域，FLNB将整合素和其他受体锚定到肌动蛋白丝上，并作为支架蛋白，参与调控细胞形状、迁移和分化的复合物的形成。此外，丝状蛋白-refilin相互作用为肌动蛋白交联特性和发育过程中的高级网络重塑提供了额外的调控机制。在骨骼发育过程中，FLNB是软骨细胞祖细胞分化和软骨内成骨的关键调控因子。FLNB的双等位基因功能缺失突变和功能获得突变均会导致不同的骨骼发育不良，例如脊椎腕跗骨融合症、拉森综合征、骨不全和回旋镖样骨发育不良，这反映了FLNB对TGF-β信号通路抑制功能的丧失或机械感觉特性的破坏。FLNB还与Formin 1和其他肌动蛋白调节因子发生物理相互作用，以协调软骨细胞的极性和迁移。其肌动蛋白结合域的致病性突变，例如W148R突变，会导致F-肌动蛋白异常聚集和细胞运动障碍，从而将FLNB对肌动蛋白的精确锚定与正常的骨骼形态发生联系起来。在成人内皮细胞中，FLNB 集中于血管内皮，并在 VEGF 诱导的细胞迁移和血管生成中发挥关键作用：在人脐静脉内皮细胞中，siRNA 介导的 FLNB 敲低会降低 VEGF 驱动的细胞迁移和体外管状结构形成，增加底物黏附和黏着斑密度，并改变 Rac-1 的定位和信号传导。在基础条件下，FLNB 与 Rac-1 及其鸟嘌呤核苷酸交换因子 Vav-2 形成信号复合物；在 VEGF 刺激下，该复合物与 VEGFR2 和整合素 αvβ5 相互作用，促进 Rac-1 激活、下游 PAK4/5/6 信号传导以及内皮细胞有效迁移所需的肌动蛋白重塑。 FLNB还调节内皮细胞中鞘氨醇-1-磷酸受体1 (S1PR1) 的细胞表面滞留，通过控制受体在肌动蛋白锚定膜结构域的转运，影响血管屏障功能和稳态。在肌肉中，不同的FLNB剪接变体表现出不同的亚细胞定位，并对肌管形态产生不同的影响。含有ASB2β的SCF样泛素连接酶复合物对FLNB的蛋白酶体降解促进肌肉分化，表明FLNB的水平和亚型组成调节肌生成。FLNB能够交联肌动蛋白，将整合素和其他受体偶联到细胞骨架上，并参与与Rac-1、Vav-2、TGF-β效应因子和泛素连接酶的信号通路，这使其成为一个多功能的结构和信号枢纽。 |
| 参考文献 |
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