FLT3 Antibody (Rabbit mAb) [H6L24]
目录号: F4080
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 293T, Lane 2: 293T (FLT3 transfected)
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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113 kDa
130 kDa (nonglycosylated);160 kDa (glycosylated)
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | SEM leukemia cells; THP-1 cells (PNGase F, 50U/mL, 2 h) |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| FLT3 Antibody (Rabbit mAb) [H6L24] 可检测内源性 FLT3 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 内质网，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| P36888 |
| 克隆号 |
|---|
| H6L24 |
| 别名 |
|---|
| CD135; CD135 antigen; fetal liver kinase 2; Fetal liver kinase-2; FL cytokine receptor; FLK-2; FLK2; FLT-3; FLT3; Stem cell tyrosine kinase 1; STK-1; STK1; Tyrosine-protein kinase receptor FLT3 |
| 背景 |
|---|
| FLT3（FMS样酪氨酸激酶3，也称为FLK2或CD135）是c-Kit/PDGFR家族中的III类受体酪氨酸激酶，表达于早期造血干细胞和祖细胞，并在其同源细胞因子FLT3配体刺激下，作为这些细胞存活、增殖和分化的关键调节因子发挥作用。该受体是一种I型跨膜糖蛋白，其胞外区包含五个免疫球蛋白样结构域，介导FLT3配体结合和受体二聚化；一个跨膜螺旋；一个近膜调节片段，在没有配体的情况下抑制激酶活性；以及一个分裂的胞质酪氨酸激酶结构域，该结构域具有多个自磷酸化位点，在受体激活时作为信号效应分子的停泊位点。由骨髓基质细胞和其他基质成分产生的FLT3配体与单体FLT3结合，促进三元复合物的形成。在该复合物中，同源二聚体FLT3L连接两个FLT3分子，使胞内激酶结构域彼此靠近，触发激活环和近膜酪氨酸的跨膜自磷酸化，并为含SH2结构域的衔接蛋白和效应蛋白提供结合平台。活化的FLT3募集并磷酸化包含Shc、Grb2、Gab1/2、SHP-2、SHIP和CrkL的复合物，这些复合物将受体连接到RAS-RAF-MEK-ERK信号通路以促进有丝分裂反应，连接到PI3K-AKT-mTOR通路以促进细胞存活和代谢支持，以及连接到JNK和p38 MAPK模块以调节造血祖细胞的应激反应、细胞因子产生和分化结果。这些信号网络与其他细胞因子受体（例如c-Kit、GM-CSF受体和白细胞介素受体）协同作用，扩增多能祖细胞，支持树突状细胞和NK细胞的发育，并维持骨髓、胸腺和淋巴器官中的干细胞和祖细胞库。FLT3配体单独使用时增殖活性较弱，但与其他生长因子联合使用时具有显著的协同效应。FLT3的表达通常局限于早期祖细胞，并在成熟后下调，但在大多数急性髓系白血病原始细胞和相当一部分急性淋巴细胞白血病中，FLT3仍持续高表达，为致癌基因的激活提供了平台。体细胞 FLT3 突变，特别是近膜区内部串联重复和激酶结构域激活点突变，是 AML 中最常见的病变之一，约占三分之一的病例，导致配体非依赖性受体二聚化或近膜自身抑制解除、慢性自身磷酸化以及 STAT5、PI3K-AKT 和 RAS-ERK 通路的组成性激活，从而驱动髓系祖细胞不受控制的增殖、存活和分化受损。 |
| 参考文献 |
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