GCN1 Antibody (Rabbit mAb) [G16A4]
目录号: F5249
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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293 kDa
295 kDa,124 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human skeletal muscle tissue; Mouse brain tissue; Mouse liver tissue; Rat liver tissue; HEK293T cells; PC-3 cells; DU-145 cells; HeLa cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：250 mA, 180 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| GCN1 Antibody (Rabbit mAb) [G16A4] 可检测内源性 GCN1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q92616 |
| 克隆号 |
|---|
| G16A4 |
| 别名 |
|---|
| GCN1L1 | KIAA0219 | GCN1 | Stalled ribosome sensor GCN1 | GCN1 eIF-2-alpha kinase activator homolog | GCN1-like protein 1 | General control of amino-acid synthesis 1-like protein 1 | Translational activator GCN1 | HsGCN1 |
| 背景 |
|---|
| GCN1（EIF2AK4 激活因子）是一种大型核糖体结合的调控蛋白，它作为碰撞传感器和蛋白激酶 GCN2 的上游激活因子发挥作用，从而将翻译状态和氨基酸可用性与整合的应激反应和共翻译质量控制相结合。该蛋白包含延伸的 HEAT 样重复序列和一个 EF3 相关区域，该区域与延伸中的核糖体接触并与其伴侣 GCN20 形成复合物；这种结构使 GCN1 能够结合二聚体和更高级的碰撞核糖体组装体，并将 GCN2 定位在核糖体亚基和 A 位点区域的界面处。当氨基酸缺乏或其他导致延伸减缓的应激条件出现时，核糖体会在A位点未被占据的情况下停滞。此时，后方的核糖体与停滞的核糖体发生碰撞，GCN1被募集到这些碰撞的核糖体上。GCN1进而募集并稳定GCN2，使其通过与碰撞的核糖体的特异性相互作用以及与A位点密码子对应的未带电荷tRNA的局部富集而被激活。激活的GCN2磷酸化真核起始因子2（eIF2）的α亚基，使eIF2转化为三元复合物循环的抑制剂，从而减弱全局的帽依赖性翻译，并促进应激反应mRNA（如ATF4）的选择性翻译，进而触发一个转录程序，该程序上调氨基酸转运蛋白和生物合成酶的表达，并恢复代谢平衡。除了经典的氨基酸反应外，GCN1 还参与对紫外线照射和其他诱导核糖体暂停的应激反应。哺乳动物遗传分析表明，GCN1 对胚胎发育、细胞增殖和正常的 G2/M 期进程至关重要，将其与核糖体相关的功能与细胞周期调控联系起来。GCN1 还直接参与以核糖体为中心的质量控制：GCN1 与碰撞的核糖体结合，促进 RNF14-RNF25 泛素连接酶通路的激活，该通路靶向延伸因子 eEF1A 和释放因子 eRF1 进行泛素化和降解，并修饰核糖体蛋白，从而将持续的核糖体停滞与关键翻译因子的清除和翻译机制的重构联系起来。 |
| 参考文献 |
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