Glu-Glu Epitope Tag Antibody (Mouse mAb) [N24M2]
目录号: F1866
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 293T, Lane 2: 293T (Glu-Glu tag-EGFP transfected)
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IF |
| 反应性 |
|---|
| Epitope tag |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的组织裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。 PVDF 膜孔径规格选择参照表
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Glu-Glu Epitope Tag Antibody (Mouse mAb) [N24M2] 可检测人工构建的 Glu-Glu 表位标签。 |
| 克隆号 |
|---|
| N24M2 |
| 别名 |
|---|
| MPyVgp2, Polyomavirus medium t antigen, Polyomavirus middle t antigen, EYMPME |
| 背景 |
|---|
| Glu-Glu表位标签是一种源自小鼠多瘤病毒中T抗原的短肽标签，最常用的形式是六肽EYMPME（H-Glu-Tyr-Met-Pro-Met-Glu-OH），它被整合到重组蛋白中，以实现高特异性的检测和分离，而不会显著改变其天然结构或功能。该标签由两个谷氨酸残基组成，两侧是核心的酪氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸序列，有时为了便于偶联，会在N端添加一个半胱氨酸（CEEEEYMPME）。这种独特的氨基酸排列形成了一个紧凑的、溶剂暴露的表位，该表位能被特异性的Glu-Glu单克隆抗体和多克隆抗体高亲和力地识别，可用于Western印迹、免疫荧光、免疫细胞化学、ELISA和免疫沉淀等实验。该标签通常通过亚克隆到表达载体（例如杆状病毒pFASTBAC系统）中，被构建到蛋白质的N端或C端，并作为惰性报告序列发挥作用：其长度短且缺乏强二级结构，可减少对蛋白质折叠或活性的干扰；同时，其明确的化学组成支持与抗体的强效结合，并在需要时通过添加半胱氨酸或焦谷氨酰修饰进行化学偶联。由于EYMPME序列不存在于大多数哺乳动物蛋白质中，且来源于病毒中T抗原，因此在典型的细胞或组织裂解液中的背景反应性较低，使得Glu-Glu标签构建体在免疫印迹中呈现清晰的条带和特异性的免疫染色信号，易于与内源性蛋白质区分开来。商业化的Glu-Glu标签抗体是针对与载体蛋白（通常为KLH）偶联的EYMPME制备的，经亲和纯化固定在肽上，并针对多种应用进行了验证。一些克隆抗体能够识别EYMPME及其密切相关的EFMPME变体，从而在保持特异性的同时，为标签设计提供了灵活性。与其他表位标签一样，Glu-Glu标签相对于信号肽、跨膜区段或靶向序列的位置需要仔细考虑，以避免掩盖标签或误导融合蛋白。但总的来说，Glu-Glu标签提供了一种结构紧凑、化学性质简单且免疫学上独特的标记，可用于追踪表达、验证蛋白大小、进行免疫沉淀以进行复杂分析以及在包括昆虫和哺乳动物细胞在内的多种系统中定量重组蛋白。 |
| 参考文献 |
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