Glutathione Peroxidase 4 Antibody (Rabbit mAb) [P24F22]
目录号: F6076
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 22Rv1, Lane 2: U-118 MG, Lane 3: U-937
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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22 kDa
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| 阳性对照 | Human ductal breast carcinoma; Human endometrioid adenocarcinoma; Human adenoid cystic carcinoma of salivary gland; Human papillary thyroid carcinoma; Human lung adenocarcinoma; Normal human colon; Human tonsil; Normal human kidney; Normal human epididymis; Normal human adrenal gland; Normal human stomach; Mouse testis; Rat testis; Human endometrioid adenocarcinoma; U-118 MG cells; Hep 3B2.1-7 cells; U-937 cells; 22Rv1 cells; 293T cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Glutathione Peroxidase 4 Antibody (Rabbit mAb) [P24F22] 可检测内源性 Glutathione Peroxidase 4 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，线粒体 |
| Uniprot ID |
|---|
| P36969 |
| 克隆号 |
|---|
| P24F22 |
| 别名 |
|---|
| epididymis secretory sperm binding protein; Glutathione peroxidase 4; GPx-4; GPX4; GSHPx-4; MCSP; PHGPx; selenoprotein GPX4; SMDS; snGPx; snPHGPx; sperm nucleus glutathione peroxidase |
| 背景 |
|---|
| GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）是一种含硒半胱氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶，在氧化还原生物学中占据着独特的地位。它是唯一一种能够直接还原生物膜和脂蛋白中复杂的磷脂和胆固醇氢过氧化物的酶，利用还原型谷胱甘肽作为电子供体，从而维持多不饱和磷脂的完整性，而这些磷脂极易受到铁驱动的过氧化作用的影响。该蛋白是一种单体氧化还原酶，其催化中心含有一个硒半胱氨酸残基，在反应 2 GSH + 磷脂-OOH → GSSG + 磷脂-OH + H₂O 过程中，该残基在硒醇和硒/硒基-谷胱甘肽中间体之间循环。这种直接作用于膜内氢过氧化物的能力使 GPX4 区别于其他主要处理可溶性过氧化物的家族成员。 GPX4活性对于抑制铁死亡至关重要。铁死亡是一种受调控的坏死性细胞死亡途径，由不受控制的铁依赖性脂质过氧化驱动。GPX4功能的丧失或抑制会导致磷脂氢过氧化物积累超过毒性阈值，进而导致膜结构崩解，最终引发铁死亡。而GPX4活性的维持足以中断脂质过氧化链式反应，即使在高氧化负荷下也能保持细胞活力。这一功能使GPX4处于Xc⁻/GSH/GPX4轴的核心位置。在该轴中，胱氨酸通过Xc⁻系统输入、谷胱甘肽合成以及GPX4活性共同构成了一条线性防御铁死亡的机制，该机制在转录水平上受到Nrf2和其他应激反应因子的支持。任何环节的破坏都会使细胞对铁死亡更加敏感，而硒的可用性和硒代半胱氨酸掺入GPX4则是其表达和活性的限速因素。 GPX4 的同工酶定位于胞质、线粒体和细胞核/睾丸，使其保护作用延伸至线粒体膜和染色质相关脂质，从而对胚胎发育、精子发生和神经元长期存活至关重要。GPX4 维持突触和髓鞘膜的完整性，并限制脂质过氧化引发的神经退行性级联反应。GPX4 表达或活性的失调会导致多种病理：GPX4 功能受损会促进缺血再灌注损伤、神经退行性变和炎症性组织损伤中的铁死亡；而 GPX4 过表达或过度依赖则是许多耐药和高间质状态癌细胞的特征，包括依赖 GPX4 介导的脂质过氧化物解毒以在化疗或靶向治疗压力下存活的耐药持续性细胞亚群。 |
| 参考文献 |
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