GOPC Antibody (Rabbit mAb) [D5A8]
目录号: F6628
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: A375, Lane 2: PC3
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IH, IF |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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51 kDa
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| 阳性对照 | Fetal kidney; Human prostate; Human stomach tissue; Normal brain tissue; Normal kidney tissue; Normal liver tissue; Normal ovary tissue; Normal breast tissue; 293T cells; HeLa cells; A375 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | PC-3 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
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| GOPC Antibody (Rabbit mAb) [D5A8] 可检测内源性 GOPC 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 着丝粒，染色体，细胞质，细胞骨架，动粒，细胞核 |
| Uniprot ID |
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| Q9HD26 |
| 克隆号 |
|---|
| D5A8 |
| 别名 |
|---|
| CAL, FIG, GOPC, Golgi-associated PDZ and coiled-coil motif-containing protein, CFTR-associated ligand, Fused in glioblastoma, PDZ protein interacting specifically with TC10, PIST |
| 背景 |
|---|
| PIST，又称GOPC或PDZ结构域蛋白8，属于PDZ结构域支架蛋白家族，该家族蛋白通过与跨膜受体C端尾部的特异性相互作用来组织细胞内信号复合物。PIST主要定位于反式高尔基网络（TGN），其结构包含一个PDZ结构域以及卷曲螺旋基序，这些基序使其能够形成同源二聚体并与多种蛋白结合，例如TC10 GTP酶、神经连接蛋白-1、代谢型谷氨酸受体5 (mGluR5) 和β1-肾上腺素能受体 (β1AR)。在生物合成转运过程中，PIST将这些受体保留在TGN中，并与质膜支架蛋白（如PSD-95）竞争，从而调节这些受体向细胞表面的转运，进而调控下游信号通路，例如β1AR激动剂激活MAPK信号通路。在激动剂刺激和 cAMP 通路激活后，PIST 会转移到内体样区室，与分选连接蛋白 1 (SNX1) 和内吞受体共定位，从而在内吞后循环过程中稳定这些受体，防止其被溶酶体降解。对于 mGluR5 和神经连接蛋白-1 等突触受体，PIST 可促进其在神经元中靶向质膜，并精确分选至海马和皮层区域的突触后致密区。PIST 的缺失会破坏 mGluR5 在突触处的定位，导致代谢型谷氨酸受体依赖性长时程抑制受损，以及情境恐惧条件反射缺陷。PIST 缺陷小鼠海马中 β1AR 水平降低，紧密连接蛋白转运改变，表明 PIST 功能失调与突触组织和更广泛的上皮屏障功能的神经退行性紊乱有关。 |
| 参考文献 |
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