GPNMB Antibody (Rabbit mAb) [H14J12]
目录号: F7372
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: SK-MEL-28, Lane 2: U-87 MG, Lane 3: SKBR3, Lane 4: A375
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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64 kDa
120 kDa,95 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | SK-MEL-28 cells; U-87 MG cells |
|---|---|
| 阴性对照 | HeLa cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| GPNMB Antibody (Rabbit mAb) [H14J12] 可检测内源性 GPNMB 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，内体，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q14956 |
| 克隆号 |
|---|
| H14J12 |
| 别名 |
|---|
| HGFIN, NMB, UNQ1725/PRO9925, GPNMB, Transmembrane glycoprotein NMB, Hematopoietic growth factor inducible neurokinin-1 type |
| 背景 |
|---|
| GPNMB，又称骨激活素，属于pMEL17/前黑素体蛋白家族，是一种IA型跨膜糖蛋白，具有较长的胞外结构域和较短的胞内结构域。这种结构体现了其双重功能：一方面参与胞外蛋白-蛋白相互作用，另一方面参与胞内信号传导。胞外结构域包含一个能够与整合素结合的RGD基序、一个可折叠成免疫球蛋白样结构的多囊肾病结构域，以及一个与蛋白结合相互作用相关的kringle样结构域。胞质尾部则包含一个半免疫受体酪氨酸激活基序和一个二亮氨酸基序，后者引导蛋白定位至溶酶体和内体。 GPNMB根据细胞环境的不同，通过多种平行机制发挥作用，它可以作为黑素体相关蛋白、膜结合表面受体、可溶性配体或黏附分子。其胞内半ITAM基序中的酪氨酸残基驱动下游信号通路，从而支持乳腺癌细胞的干细胞样特性和恶性进展。蛋白水解脱落可使胞外结构域从细胞表面释放，该可溶性片段与整合素相互作用，将免疫抑制细胞和促血管生成细胞募集到肿瘤微环境中，通过与细胞自主信号通路平行的旁分泌途径，将GPNMB的促肿瘤作用扩展到其来源细胞之外。在同一肿瘤细胞内，GPNMB通过调节受体酪氨酸激酶和整合素信号通路激活下游激酶级联反应，进而触发基质金属蛋白酶和细胞因子的表达和分泌，从而促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。因此，该蛋白既在细胞内发挥作用，也通过微环境重塑发挥促肿瘤作用。除肿瘤学领域外，GPNMB还调节骨骼中破骨细胞的分化和活性，参与多种组织类型的细胞分化、迁移和神经保护，并参与炎症和免疫介导的过程，包括抑制T细胞活化。在多种神经退行性疾病和神经炎症性疾病中，脑脊液和组织中的GPNMB水平升高，并且在包括狼疮性肾炎在内的免疫介导性肾脏疾病中也有GPNMB的表达。这使得GPNMB除了在黑色素瘤、胶质母细胞瘤和三阴性乳腺癌中具有已知的相关性外，还可作为自身免疫性疾病和神经系统疾病中巨噬细胞和小胶质细胞活化的标志物。GPNMB具有胞外整合素结合基序、依赖于脱落的旁分泌机制以及具有信号传导能力的胞质尾，这些特性使其成为研究肿瘤微环境重塑、破骨细胞生物学以及各种疾病背景下免疫细胞活化的研究人员的重要靶点。 |
| 参考文献 |
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