Hamartin/TSC1 Antibody [N1E19]

目录号: F0483

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:50

抗体应用
WB, IP

反应性
Human, Mouse, Rat

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
150-170 kDa

阳性对照	MEF cells; HT-1080 cells; Rat2 cells; HAP1 cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Hamartin/TSC1 Antibody [N1E19] 可检测内源性 Hamartin/TSC1 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞质，溶酶体，内膜系统

Uniprot ID
Q92574

克隆号
N1E19

别名
Hamartin; Tuberous sclerosis 1 protein; TSC1 1; KIAA0243; TSC

背景
肿瘤抑制基因TSC1的蛋白产物Hamartin与结节蛋白（TSC2）形成异二聚体GTP酶激活蛋白复合物，该复合物负调控mTORC1信号通路。该复合物加速Rheb蛋白上的GTP水解，抑制下游合成代谢过程，例如通过S6K1磷酸化和5'TOP mRNA翻译抑制蛋白质合成，尤其是在生长因子、营养或能量胁迫条件下。Hamartin包含一个N端卷曲螺旋结构域，该结构域通过静电相互作用介导与TSC2的异二聚化；一个中央Rho激活结构域，该结构域含有关键的精氨酸和赖氨酸基序，这些基序有助于通过ERM蛋白（如ezrin、radixin和moesin）锚定到肌动蛋白细胞骨架上；以及多个磷酸化位点，这些位点在G2/M期被CDK1靶向，从而调节复合物的稳定性。 TSC1-TSC2复合物整合来自溶酶体AKT、AMPK和REDD1等通路的多种信号，抑制Rheb-GTP，从而阻止mTORC1的募集和激活，维持细胞静止状态。除了TSC2之外，错构瘤蛋白（hamartin）还能促进黏着斑的组装和RhoA的激活，从而支持细胞黏附、迁移、神经元中间丝锚定和囊泡运输。错构瘤蛋白在器官发生过程中对细胞增殖的调控至关重要。TSC1的缺失会导致mTORC1持续过度激活，进而导致脑（如皮质结节和室管膜下巨细胞星形细胞瘤）、肾（血管平滑肌脂肪瘤）、心脏（横纹肌瘤）和皮肤中错构瘤的形成。致病性突变通常会破坏TSC2的结合或卷曲螺旋结构域的稳定性，导致结节性硬化症，这是一种常染色体显性遗传疾病，其特征是癫痫、自闭症和肿瘤的发生。

背景

肿瘤抑制基因TSC1的蛋白产物Hamartin与结节蛋白（TSC2）形成异二聚体GTP酶激活蛋白复合物，该复合物负调控mTORC1信号通路。该复合物加速Rheb蛋白上的GTP水解，抑制下游合成代谢过程，例如通过S6K1磷酸化和5'TOP mRNA翻译抑制蛋白质合成，尤其是在生长因子、营养或能量胁迫条件下。Hamartin包含一个N端卷曲螺旋结构域，该结构域通过静电相互作用介导与TSC2的异二聚化；一个中央Rho激活结构域，该结构域含有关键的精氨酸和赖氨酸基序，这些基序有助于通过ERM蛋白（如ezrin、radixin和moesin）锚定到肌动蛋白细胞骨架上；以及多个磷酸化位点，这些位点在G2/M期被CDK1靶向，从而调节复合物的稳定性。 TSC1-TSC2复合物整合来自溶酶体AKT、AMPK和REDD1等通路的多种信号，抑制Rheb-GTP，从而阻止mTORC1的募集和激活，维持细胞静止状态。除了TSC2之外，错构瘤蛋白（hamartin）还能促进黏着斑的组装和RhoA的激活，从而支持细胞黏附、迁移、神经元中间丝锚定和囊泡运输。错构瘤蛋白在器官发生过程中对细胞增殖的调控至关重要。TSC1的缺失会导致mTORC1持续过度激活，进而导致脑（如皮质结节和室管膜下巨细胞星形细胞瘤）、肾（血管平滑肌脂肪瘤）、心脏（横纹肌瘤）和皮肤中错构瘤的形成。致病性突变通常会破坏TSC2的结合或卷曲螺旋结构域的稳定性，导致结节性硬化症，这是一种常染色体显性遗传疾病，其特征是癫痫、自闭症和肿瘤的发生。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10806479/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23857276/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%