HDAC5 Antibody (Mouse mAb) [B2J1]
目录号: F4739
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Saso-2, Lane 2: Hela, Lane 3: T47D, Lane 4: THP-1
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, ChIP |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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140 kDa
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| 阳性对照 | THP-1 cells; 3T3-L1 undifferentiated cells; COS7 cells; NIH/3T3 cells; KNRK cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| HDAC5 Antibody (Mouse mAb) [B2J1] 可检测内源性 HDAC5 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
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| Q9UQL6 |
| 克隆号 |
|---|
| B2J1 |
| 别名 |
|---|
| Histone deacetylase 5, HD5, Antigen NY-CO-9, HDAC5, KIAA0600 |
| 背景 |
|---|
| HDAC5 是一种 IIa 类组蛋白去乙酰化酶，作为信号调控的转录共抑制因子，将细胞外和细胞内信号与染色质去乙酰化以及肌肉、内皮、心脏、大脑和癌症中特定基因程序的抑制联系起来。该蛋白包含一个 N 端调控区，该调控区具有多个丝氨酸磷酸化位点、14-3-3 结合基序以及与 MEF2、GATA1 和 SATB1 等转录因子相互作用的区域；以及一个 C 端催化结构域，该结构域具有保守的 HDAC 折叠，当与 HDAC3 和 NCOR/SMRT 组装成多蛋白复合物时，可使核心组蛋白 N 端尾部的赖氨酸去乙酰化。 HDAC5 与 MEF2 或其他转录因子结合于靶启动子，维持低组蛋白乙酰化水平、紧密染色质状态，并降低参与肌生成、血管生成、炎症反应和致癌程序的基因的转录。其定位或修饰状态的改变会迅速改变这些基因的表达。CaMK、PKD、AMPK、SIK1 和 GRK5 等激酶对 HDAC5 关键丝氨酸残基的磷酸化，可形成 14-3-3 蛋白的高亲和力结合位点，并触发 CRM1 依赖的核输出，从而解除对 MEF2 依赖性基因和其他靶基因的抑制，并允许肌肉分化和肥大基因的表达响应钙、肾上腺素能和代谢信号而激活。 PP2A-B55α复合物介导的去磷酸化或磷酸化受损会促进HDAC5的核内滞留和持续抑制，这些相反的磷酸化-去磷酸化循环整合了神经激素和机械输入，从而动态调控心肌细胞和血管细胞中HDAC5的核定位。在内皮细胞中，HDAC5是血管生成基因表达谱的关键决定因素：核内HDAC5抑制促血管生成基因，而VEGF和剪切应力诱导的HDAC5输出则增强MEF2驱动的转录，增加血管生成介质的表达，并促进血管萌芽和管状结构形成。在癌症中，HDAC5经常发生异常调控，HDAC5水平或定位的改变通过对染色质和非组蛋白底物（包括RARA和SATB1）的去乙酰化作用，影响细胞增殖、迁移、上皮-间质转化、癌症干性以及药物敏感性。 |
| 参考文献 |
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