HLA E Antibody (Mouse mAb) [G19G18]
目录号: F7769
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: A549, Lane 2: A549 (KO HLA-E), Lane 3: THP-1, Lane 4: Jurkat
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议曝光 60s 以上。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议曝光 60s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC, FCM |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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40 kDa
40 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human tonsil; THP-1 cells; A549 cells; Jurkat cells; HEK-293T cells; HL60 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| HLA E Antibody (Mouse mAb) [G19G18] 可检测内源性 HLA E 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，高尔基体，内膜系统，MHC I 类蛋白复合物，细胞外环境 |
| Uniprot ID |
|---|
| P13747 |
| 克隆号 |
|---|
| G19G18 |
| 别名 |
|---|
| HLA-6.2, HLAE, HLA-E, MHC class I antigen E |
| 背景 |
|---|
| HLA-E 是一种非经典的 MHC I 类分子，属于 HLA-Ib 家族，其多态性非常有限。它由一条重链（包含 α1、α2 和 α3 结构域）和一条 β2-微球蛋白组成异二聚体，并呈递一种受限的肽库，该肽库主要由一种保守的 VL9 九肽组成，该九肽来源于 HLA-A、-B、-C 和 -G 的信号序列。其肽结合槽的结构与经典的 HLA-I 分子相似，但在所有结合口袋处都存在一些适应性变化，这些变化赋予了 HLA-E 对 VL9 型肽的高度特异性。HLA-E 利用贯穿整个结合槽的侧链接触来优先结合这些信号肽衍生的配体，并维持相对稳定的肽受体 HLA-E-β2m 复合物，该复合物也能容纳一些效力较弱的病原体衍生肽。 HLA-E-肽复合物被转运至细胞表面，并与NK细胞和部分CD8⁺ T细胞亚群上的CD94/NKG2x受体相互作用；抑制性CD94/NKG2A或NKG2B通过ITIM基序的结合会降低NK细胞的细胞毒性和IFN-γ的产生，而激活性CD94/NKG2C通过DAP12 ITAM衔接蛋白的结合则会促进NK细胞活化、增强适应性NK细胞亚群的扩增以及在病毒感染期间增强效应功能。CD94/NKG2受体跨越α1/α2平台与肽结合，其中VL9序列直接参与受体界面，因此信号肽的供应或序列的变化会调节受体亲和力以及抑制性和激活性信号之间的平衡。 HLA-E还能将来自细菌和病毒的多种非VL9肽呈递给CD8⁺ T细胞，而HLA-E限制性T细胞受体（TCR）识别这些复合物，并触发经典的CD3-ζ、ITAM、ZAP-70、LAT、PI3K、MAPK、NF-κB和NFAT信号通路，从而支持细胞毒活性和细胞因子产生，为HLA-E的生物学功能增添了适应性作用。HLA-E的表达和转运依赖于TAP介导的肽加载和细胞内转运途径，这与某些经典的HLA-I分子不同。此外，从内皮细胞和其他组织脱落的可溶性HLA-E已被描述为一种能够与CD94/NKG2受体结合的额外免疫调节形式。许多病毒和肿瘤通过改变前导肽的可用性、诱导表达或提供自身肽来调节 HLA-E，这些肽与 HLA-E 结合并优先通过抑制性 NKG2A 发出信号，而多种恶性肿瘤中高水平的 HLA-E 与 NK 和 T 细胞反应受损以及免疫逃逸有关。 |
| 参考文献 |
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