IGFBP3 Antibody (Rabbit mAb) [G15L3]
目录号: F9208
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: AsPC-1
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC, IF |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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19 kDa
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| 阳性对照 | Normal human pancreas; Normal human kidney; Human urothelial carcinoma; Human renal cell carcinoma; Human endometroid carcinoma; Human urothelial carcinoma; HCC1937 cells; OVCAR-4 cells; HCC1143 cells; AsPC-1 cells; A-498 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | HT-29 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| IGFBP3 Antibody (Rabbit mAb) [G15L3] 可检测内源性 IGFBP3 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞核，细胞外环境 |
| Uniprot ID |
|---|
| P17936 |
| 克隆号 |
|---|
| G15L3 |
| 别名 |
|---|
| acid stable subunit of the 140 K IGF complex; binding protein 29; binding protein 53; BP-53; IBP-3; IBP3; IGF-binding protein 3; IGFBP-3; IGFBP3; insulin like growth factor binding protein 3 |
| 背景 |
|---|
| 胰岛素样生长因子结合蛋白-3 (IGFBP3) 是人体循环中六个IGFBP家族成员中最丰富的成员，主要作为胰岛素样生长因子IGF-I和IGF-II的主要载体蛋白，与酸不稳定亚基形成三元复合物。IGFBP3可将IGF的半衰期从几分钟延长至超过12小时，并通过高亲和力螯合调节IGF的生物利用度。IGFBP3包含三个结构域：一个高度保守的富含半胱氨酸的N端结构域，含有12个半胱氨酸残基，形成6个域内二硫键；一个非保守的中央连接结构域；以及一个保守的富含半胱氨酸的C端结构域，含有6个半胱氨酸残基，形成3个二硫键。这两个末端结构域通过不同的接触残基协同作用，共同产生纳摩尔级的结合亲和力，从而促进IGF的结合。该蛋白质经历翻译后修饰，包括三个天冬酰胺残基（Asn89、Asn109、Asn172）的 N-糖基化，导致碳水化合物含量变化，产生可通过蛋白质印迹检测到的特征性双条带；酪蛋白激酶 2 和 DNA 依赖性蛋白激酶在多个丝氨酸残基上的磷酸化，改变糖胺聚糖结合和 IGF 亲和力；以及基质金属蛋白酶和妊娠相关血浆蛋白 A2 的蛋白水解切割，降低 IGF 结合亲和力，从而释放具有生物活性的 IGF 以激活受体。 IGFBP3 通过多种机制调节 IGF 依赖性细胞过程——通过隔离 IGF-I 和 IGF-II 阻止受体接近，从而经典地抑制 IGF1R 信号传导；通过与细胞表面糖胺聚糖和细胞外基质蛋白相互作用，将 IGF 集中在受体附近，从而增强 IGF1R 的激活；以及通过与转化生长因子-β 受体 V 型 (TGFβRV/LRP1) 结合后激活蛋白磷酸酶 2A，从而抑制 IGF1R 信号传导，导致 Akt 和 Ras/MAPK 通路成分去磷酸化。该蛋白通过与跨膜蛋白219 (TMEM219)、TGFβRI、TGFβRII和TGFβRV受体的相互作用，在细胞表面执行广泛的IGF非依赖性功能。TMEM219的结合触发caspase-8依赖性细胞凋亡，并形成钙/钙调蛋白依赖性复合物诱导自噬；而TGFβRV的配体结合激活蛋白磷酸酶2A，下调Akt存活通路。IGFBP3具有细胞穿透肽特性，这由其C端区域内重叠的糖胺聚糖结合域、核定位信号域和金属结合域介导，使其能够通过转铁蛋白受体相互作用介导的网格蛋白内吞作用、涉及caveolin-1的caveolae介导的内吞作用以及液相胞饮作用进入细胞，其中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖促进其与细胞膜的结合和内化。内吞后，IGFBP3 通过直接与 importin-β 结合，以 ATP 和 GTP 依赖的方式转位至细胞核，该过程不依赖于 importin-α 衔接蛋白。其 C 端结构域内的双元核定位信号引导 IGFBP3 在细胞核内积累，并受多聚泛素化和蛋白酶体降解的调控。核内 IGFBP3 通过与 II 类核激素受体（包括类视黄醇 X 受体-α 和维生素 D 受体）相互作用发挥转录调节作用，调节它们的转录活性；它还能与 DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基结合，参与非同源末端连接双链 DNA 修复途径；此外，它还与多种转录因子相互作用，影响调控细胞凋亡、细胞周期进程和代谢稳态的基因表达程序。 IGFBP3 通过多种机制调节自噬——在葡萄糖和氧气缺乏的情况下，低糖基化的 IGFBP3 与葡萄糖调节蛋白 78 (GRP78) 结合，诱导营养胁迫的乳腺癌细胞的自噬存活反应；TMEM219-钙调蛋白-钙/钙调蛋白依赖性激酶 II 复合物的形成触发肾脏上皮细胞的自噬；支气管上皮细胞中白细胞介素-13 诱导的自噬依赖于 IGFBP3；而在角膜上皮中，IGFBP3 通过调节 BNIP3L/NIX 线粒体自噬受体的表达来抑制线粒体自噬，维持线粒体功能，核积累与线粒体呼吸和嵴形态的改变相关。该蛋白质通过上调鞘氨醇激酶 1 的活性来调节鞘脂代谢，生成促生存的鞘氨醇 1-磷酸，同时降低促凋亡的神经酰胺水平，通过鞘氨醇 1-磷酸受体信号传导增强配体依赖性的 IGF1R 和 EGFR 的激活，其中 EGFR 反式激活 IGF1R 而不依赖于 IGF 结合。 IGFBP3 表现出依赖于环境的促凋亡或抗凋亡功能——该蛋白通过 caspase 依赖性机制诱导前列腺癌细胞凋亡，该机制独立于 IGF 结合、分泌或核浓度；激活 STAT-1 并抑制乳腺癌细胞中的 Akt/IGF-1R 生存通路，促进凋亡；然而矛盾的是，三阴性乳腺癌异种移植瘤中高水平的核 IGFBP3 与裂解的 caspase-3 呈负相关，并预示着生存期缩短，肿瘤生长是由 IGFBP3 刺激的鞘氨醇激酶 1 和 EGFR 激活驱动的。 IGFBP3 的表达在转录和翻译后水平受到调控，其紊乱与多种恶性肿瘤有关——循环 IGFBP3 减少与 IGF-I 升高相关，与乳腺癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌风险增加相关；p53 肿瘤抑制因子直接诱导 IGFBP3 转录，使其成为 p53 调控的生长抑制剂；恶性细胞中的 IGFBP3 水平相对于正常组织下降；前列腺癌中核 IGFBP3 升高可显著预测肿瘤复发，同时可作为预后标志物和潜在的治疗靶点。 |
| 参考文献 |
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