IKKα Antibody [B4D5]
目录号: F5071
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HCT116, Lane 2: Daudi, Lane 3: A549, Lane 4: A20
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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85 kDa
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| 阳性对照 | HCT‑116 cells; Daudi cells; A549 cells; KNRK cells; BaF3 cells; A20 cells; YB2/0 cells |
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| 阴性对照 | SK-OV-3 cells |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| IKKα Antibody [B4D5] 可检测内源性 IKKα 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
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| O15111 |
| 克隆号 |
|---|
| B4D5 |
| 别名 |
|---|
| Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit alpha; I-kappa-B kinase 1; IKK-A; IKK-alpha; IkappaB kinase alpha; IKK1; Conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase; Nuclear factor NF-kappa-B inhibitor kinase alpha; NFKBIKA; CHUK; IKKA |
| 背景 |
|---|
| IKKα与IKKβ共同构成IκB激酶复合物的两个催化亚基之一，NEMO则在经典的NF-κB通路中作为调控支架蛋白发挥作用。该蛋白包含一个N端激酶结构域、一个中央泛素结合亮氨酸拉链基序以及一个C端螺旋-环-螺旋结构域，后者介导二聚化和复合物组装。上游激酶（如NIK和TAK1）通过磷酸化激活环内的丝氨酸残基激活IKKα，诱导构象变化，从而使底物能够接近并发生反式自磷酸化。IKKα磷酸化IκBα的32位和36位丝氨酸残基，使其发生K48连接的泛素化和蛋白酶体降解，从而释放NF-κB二聚体，使其转位至细胞核并转录参与炎症、细胞存活和增殖的基因。在非经典通路中，NIK稳定并激活二聚体IKKα，后者磷酸化p100/RelB前体，触发其加工成p52/RelB，从而驱动淋巴器官发生和B细胞存活。IKKα与RIP1、TRAF2/3和TAX1BP1相互作用，通过负反馈（包括A20介导的接头蛋白去泛素化）来微调信号持续时间。除NF-κB外，IKKα还磷酸化组蛋白H3、Raptor和TSC1，从而整合角质形成细胞和成纤维细胞中的代谢调控与细胞因子反应。在TNF刺激下，IKKα与IKKβ二聚化可增强IκBα的周转，而NEMO多聚泛素化则将IKKα募集到受体复合物的信号转导平台。通过放大或组成型激活导致的失调会促进慢性炎症、鳞状细胞癌和类风湿性关节炎的进展。 |
| 参考文献 |
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