IL-18 Antibody (Rabbit mAb) [D17G22]
目录号: F7289
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC, FCM |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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22 kDa
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| 阳性对照 | Human Hodgkin lymphoma; Human colon carcinoma; Human urothelial carcinoma; Human adenocarcinoma of distal esophagus; Human mantle cell lymphoma; Human tonsil; human appendix; Normal human thymus; Normal human skin; Normal human liver; Normal human esophagus; OVCAR-8 cells; Normal human kidney; Normal human esophagus; HeLa |
|---|---|
| 阴性对照 | Raji cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| IL-18 Antibody (Rabbit mAb) [D17G22] 可检测内源性 IL-18 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞质，细胞外环境 |
| Uniprot ID |
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| Q14116 |
| 克隆号 |
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| D17G22 |
| 别名 |
|---|
| IFN-gamma-inducing factor; IGIF; IL 18; IL-1 gamma; IL-18; IL-1g; IL18; IL1F4; Interleukin-1 gamma; Interleukin-18; MGC12320 |
| 背景 |
|---|
| 白细胞介素-18 (IL-18)，最初被鉴定为干扰素-γ诱导因子，是一种IL-1家族细胞因子，由髓系和非髓系细胞以无活性的胞质前体形式产生，并经炎症小体相关caspase-1或中性粒细胞蛋白酶-3、弹性蛋白酶和组织蛋白酶等其他蛋白酶转化为成熟的分泌形式，这使得IL-18位于先天性危险感知和细胞焦亡通路下游。成熟的细胞因子与由IL-18Rα (IL-1R7)和IL-18Rβ (IL-18RAP)组成的异二聚体受体结合； IL-18 首先以低亲和力与 IL-18Rα 结合，然后募集 IL-18Rβ 形成高亲和力信号复合物，其胞内 Toll/IL-1 受体 (TIR) 结构域组装 MyD88–IRAK–TRAF6 接头和激酶平台，激活 NF-κB 和 AP-1，以及 p38、JNK 和 PI3K–Akt 模块，从而导致 IFNG 和多种促炎细胞因子、趋化因子、粘附分子和 Fas 配体的强效转录。这种信号特征使 IL-18 能够作为 Th1 CD4⁺ T 细胞、CD8⁺ T 细胞、NK 细胞和 NKT 细胞产生干扰素-γ 的主要共刺激因子，尤其是在与 IL-12、IL-15、IL-2 或 IL-23 联合作用时，并增强 NK 和 CD8⁺ 细胞的细胞毒性、巨噬细胞活化以及一氧化氮、基质金属蛋白酶和炎症趋化因子的表达，使 IL-18 处于 Th1 偏向细胞因子级联反应的顶端附近。在缺乏IL-12或IL-15的情况下，IL-18通过作用于肥大细胞和嗜碱性粒细胞诱导IL-4和IL-13，从而促进Th2和固有2型免疫反应，并促进产生IL-17的γδ T细胞和巨噬细胞活化，这表明IL-18具有依赖于环境的效应程序支持能力，其作用取决于周围的细胞因子环境和受体表达模式。IL-18的生物活性受到分泌的高亲和力诱饵IL-18结合蛋白（IL-18BP）的严格控制，IL-18BP可螯合成熟的IL-18并阻止IL-18Rα的结合；此外，IL-18还受到相关的抗炎细胞因子IL-37的调控，IL-37可与IL-1R8形成复合物，从而与IL-18Rα结合并传递抑制信号。只有未结合的“游离”IL-18才具有生物活性，血清中游离IL-18水平极度升高可导致一组自身炎症性疾病，称为“IL-18病”，包括NLRC4相关巨噬细胞活化综合征、全身型幼年特发性关节炎和成人斯蒂尔病，IL-18BP疗法在这些疾病中显示出临床疗效。在结构层面，IL-18采用与IL-1β密切相关的β-三叶折叠结构。IL-18与IL-18Rα和IL-18Rβ结合的晶体学分析揭示了一个三位点结合界面，这解释了其受体特异性，并为设计IL-18突变体和靶向受体的拮抗剂提供了框架，这些突变体和拮抗剂可在选择性调节信号传导的同时，保留或增强其抗肿瘤功能。在宿主防御中，IL-18 通过增强 Th1 和细胞毒性反应，有助于清除包括病毒和细菌在内的细胞内病原体；而失调或慢性升高的 IL-18 会导致各种炎症和代谢疾病（如动脉粥样硬化、心肌梗死、慢性阻塞性肺病、克罗恩病和噬血细胞综合征）中的组织损伤。 |
| 参考文献 |
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