IL-6 Antibody [L17N21]

目录号: F4193

抗体应用：反应性：Human

Lane 1: Recombinant Human Interleukin-6

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

操作要点

WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:100

抗体应用
WB, IP

反应性
Human

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
21-28 kDa

阳性对照	Recombinant Human Interleukin-6 (hIL-6); NK-92 cells (treated with TPA, ionomycin, BFA); NCI-H460 cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
IL-6 Antibody [L17N21] 可检测内源性 IL-6 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞外环境

Uniprot ID
P05231

克隆号
L17N21

别名
B cell stimulatory factor-2; B-cell differentiation factor; B-cell stimulatory factor 2; BSF-2; BSF2; CDF; HGF; HSF; Hybridoma growth factor; interleukin BSF-2; Interleukin-6

背景
白细胞介素-6 (IL-6) 属于IL-6细胞因子家族，该家族成员均以gp130作为共同的信号转导受体亚基。该蛋白呈四螺旋束结构，拓扑结构为上-上-下-下，其中螺旋A-D通过环状结构连接，CD环中包含一个微螺旋；185个氨基酸残基中有157个排列有序，而N端（残基1-18）和A-B环部分则保持无序状态。 IL-6 首先与 IL-6Rα 结合，其胞外区包含三个结构域：N 端 Ig 样结构域 D1（氨基酸残基 1-93），通过二硫键（D2 中的 C6-C174）与细胞因子结合；细胞因子结合结构域 D2（氨基酸残基 94-194）；以及形成纤连蛋白 III 型模块的 D3（氨基酸残基 195-299），该模块具有 WSXWS 基序（氨基酸残基 284-287）。IL-6 与 IL-6Rα 结合发生在 D2-D3 连接处，通过氨基酸残基 P162、E163（L3）、S228、F229、Y230、R231（L5）、E278 和 F279（L7）相互作用，从而实现受体头尾二聚化，并通过疏水相互作用（如 F134 和 F168）进行连接。 IL-6/IL-6Rα异二聚体募集gp130，其膜远端Ig样D1结构域和细胞因子结合D2-D3结构域与IL-6的II和III结合位点相互作用，形成2:2:2六聚体复合物，该复合物可使gp130二聚化以进行信号传导。IL-6由T细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生，它通过促使肝细胞生成C反应蛋白和急性期蛋白来启动急性期反应。IL-6促进B细胞分化为浆细胞，促进胸腺细胞和T细胞增殖，并与TGF-β共同促进Th17细胞发育。[用户提供] gp130二聚化激活JAK/STAT（主要是STAT3）、SHP-2/ERK MAPK和PI3K通路，从而驱动炎症、造血和免疫调节相关基因的表达。可溶性IL-6Rα促进缺乏膜IL-6Rα的gp130阳性细胞的跨膜信号传导，从而在炎症条件下增强其对内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌的作用。IL-6水平升高促进肿瘤生长、VEGF介导的血管生成和转移，尤其是在乳腺癌中。信号传导失调是类风湿性关节炎、多发性骨髓瘤、前列腺癌、绝经后骨质疏松症和心血管炎症的病理基础。

背景

白细胞介素-6 (IL-6) 属于IL-6细胞因子家族，该家族成员均以gp130作为共同的信号转导受体亚基。该蛋白呈四螺旋束结构，拓扑结构为上-上-下-下，其中螺旋A-D通过环状结构连接，CD环中包含一个微螺旋；185个氨基酸残基中有157个排列有序，而N端（残基1-18）和A-B环部分则保持无序状态。 IL-6 首先与 IL-6Rα 结合，其胞外区包含三个结构域：N 端 Ig 样结构域 D1（氨基酸残基 1-93），通过二硫键（D2 中的 C6-C174）与细胞因子结合；细胞因子结合结构域 D2（氨基酸残基 94-194）；以及形成纤连蛋白 III 型模块的 D3（氨基酸残基 195-299），该模块具有 WSXWS 基序（氨基酸残基 284-287）。IL-6 与 IL-6Rα 结合发生在 D2-D3 连接处，通过氨基酸残基 P162、E163（L3）、S228、F229、Y230、R231（L5）、E278 和 F279（L7）相互作用，从而实现受体头尾二聚化，并通过疏水相互作用（如 F134 和 F168）进行连接。 IL-6/IL-6Rα异二聚体募集gp130，其膜远端Ig样D1结构域和细胞因子结合D2-D3结构域与IL-6的II和III结合位点相互作用，形成2:2:2六聚体复合物，该复合物可使gp130二聚化以进行信号传导。IL-6由T细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生，它通过促使肝细胞生成C反应蛋白和急性期蛋白来启动急性期反应。IL-6促进B细胞分化为浆细胞，促进胸腺细胞和T细胞增殖，并与TGF-β共同促进Th17细胞发育。[用户提供] gp130二聚化激活JAK/STAT（主要是STAT3）、SHP-2/ERK MAPK和PI3K通路，从而驱动炎症、造血和免疫调节相关基因的表达。可溶性IL-6Rα促进缺乏膜IL-6Rα的gp130阳性细胞的跨膜信号传导，从而在炎症条件下增强其对内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌的作用。IL-6水平升高促进肿瘤生长、VEGF介导的血管生成和转移，尤其是在乳腺癌中。信号传导失调是类风湿性关节炎、多发性骨髓瘤、前列腺癌、绝经后骨质疏松症和心血管炎症的病理基础。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32765502/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12461182/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

技术支持

在订购、运输、储存和使用我们的产品的任何阶段，您遇到的任何问题，均可以通过拨打我们的热线电话400-668-6834，或者技术支持邮箱tech@selleck.cn，直接联系到我们。我们会在24小时内尽快联系您。

* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%