INCENP Antibody (Mouse mAb) [L10F19]
目录号: F6821
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: 293T, Lane 3: HCT116, Lane 4: U2OS
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IF |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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105 kDa
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| 阳性对照 | HeLa cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| INCENP Antibody (Mouse mAb) [L10F19] 可检测内源性 INCENP 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 着丝粒，染色体，细胞质，细胞骨架，动粒，微管，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q9NQS7 |
| 克隆号 |
|---|
| L10F19 |
| 别名 |
|---|
| binds and activates aurora-B and -C in vivo and in vitro; chromosomal passenger; chromosomal passenger protein; inner centromere protein antigens 135/155kDa; inner centromere protein INCENP |
| 背景 |
|---|
| INCENP（内着丝粒蛋白）是染色体乘客复合体（CPC）的核心支架蛋白，它通过在有丝分裂过程中将Aurora B激酶与着丝粒染色质和纺锤体微管物理连接，协调染色体分离、错误校正和胞质分裂。INCENP的N端区域与Survivin和Borealin形成平行的三螺旋束，构成CPC定位模块。该模块首先将复合体广泛定位于染色体臂上，然后在有丝分裂中期定位于内着丝粒，最后在后期和末期定位于纺锤体中区和中体。而C端IN-box元件则包裹在Aurora B的小叶周围，为催化亚基提供主要的激活界面。人源Aurora B与INCENP IN-box的结合表明，INCENP通过变构作用稳定活性样T环构象，打开催化裂隙，并将关键残基定位在活性位点。随后，INCENP C端两个丝氨酸的磷酸化进一步使复合物进入完全活性激酶状态，从而建立了一个两步机制：INCENP首先启动Aurora B，然后在磷酸化后最大程度地激活Aurora B。INCENP和Aurora B相互依赖：INCENP对于Aurora B的正确定位及其组蛋白H3 Ser10激酶活性至关重要；而Aurora B对于INCENP在着丝粒的积累以及在后期转移到纺锤体至关重要。任何一个组分的缺失都会导致组蛋白H3磷酸化、中期染色体排列、姐妹着丝粒分离和胞质分裂完成的严重缺陷，但不会完全阻断后期的开始。 INCENP 的中央固有无序区如同一个灵活的“狗绳”，将着丝粒结合的 CPC 核心与动粒和微管底物连接起来；该无序区段内的磷酸化调节其延伸和内聚性，从而调节 Aurora B 在着丝粒-动粒轴内侧的覆盖范围和动态采样，进而影响张力感知和空间误差校正梯度，该梯度会破坏错误的微管-动粒连接。有丝分裂细胞中 INCENP 的缺失会破坏 Aurora B 向着丝粒的募集，损害纺锤体检查点信号传导，使细胞以错位或滞后染色体退出有丝分裂，并导致频繁的胞质分裂失败，所有这些都会导致染色体不稳定；在减数分裂中，INCENP 和 Aurora B 还对于着丝粒定位的 shugoshin MEI-S332 以及姐妹染色单体黏连的维持至关重要，这表明 CPC 活性与特化的减数分裂着丝粒行为密切相关。在结直肠癌和其他肿瘤细胞系中，INCENP 的过表达使其与 Aurora B 在中期染色体和中体上共定位；而在模型系统中，Aurora B 和 INCENP 的共过表达则会显著破坏染色体分离，这与 CPC 化学计量比的改变在肿瘤相关非整倍体以及调节对 Aurora B 抑制剂的敏感性方面所起的作用相一致。在这些情况下，INCENP 作为模块化的 CPC 组织者和 Aurora B 激活因子发挥作用，其结构化的 N 端和 C 端结构域以及磷酸化调控的无序连接区共同决定了 Aurora B 在染色质和微管底物上的作用位置和方式。 |
| 参考文献 |
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