Integrin β4 Antibody (Rabbit mAb) [A13J24]
目录号: F4858
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Mouse pancreas
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Mouse, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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202 kDa
210 kDa, 200 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human skin; Human pancreas; Mouse pancreas tissue; Mouse skin; Human colon tissue; Human cervical carcinoma tissue; Mouse ovary tissue; Mouse spleen tissue; Mouse kidney tissue; SW480 cells; HAP1 cells; A549 cells; BxPC-3 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：250 mA, 180 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Integrin β4 Antibody (Rabbit mAb) [A13J24] 可检测内源性 Integrin β4 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞连接，细胞膜，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| P16144 |
| 克隆号 |
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| A13J24 |
| 别名 |
|---|
| CD104, Integrin beta-4, GP150, ITGB4 |
| 背景 |
|---|
| 整合素β4是一种非传统的β整合素亚基，它几乎只与整合素α6配对形成α6β4异二聚体。该异二聚体是一种层粘连蛋白受体，能够组织半桥粒，并作为信号枢纽，连接细胞外基质和细胞内通路，调控上皮组织和癌细胞的黏附、存活和迁移。α6β4复合物跨越质膜，其经典的整合素胞外结构域可与基底膜上的层粘连蛋白-332结合。但β4的独特之处在于其异常长的胞质尾，该胞质尾包含多个纤连蛋白III型样结构域和富含酪氨酸的调控基序。这些结构域为稳定半桥粒中的细胞连接蛋白（如plectin和BPAG1e）以及受体动员成运动结构时的信号分子提供对接位点。半桥粒的组装由β4通过其胞质内与plectin的结合启动，plectin将整合素连接到角蛋白中间丝，而胞外α6β4头部与层粘连蛋白结合，从而形成锚定单元，赋予基底角质形成细胞和基底膜之间牢固的机械连接；小鼠中β4的基因缺失消除了半桥粒，导致α6下调，导致复层上皮与基底膜的脆弱连接，并导致类似于交界性大疱性表皮松解症的组织紊乱。生长因子和趋化因子信号通路可触发β4胞质尾的磷酸化依赖性重塑，包括蛋白激酶C驱动的事件，该事件使α6β4从半桥粒复合物中解离，并促进其重新分布至富含肌动蛋白的片状伪足和丝状伪足。在这些伪足中，整合素参与动态黏附周转，并驱动细胞在含层粘连蛋白的基质上进行趋化性迁移。在这些运动结构中，β4参与整合受体酪氨酸激酶的信号网络；β4与c-Met和其他受体形成复合物，β4胞质结构域中的关键酪氨酸残基（Y1494）控制Shp2和Src的募集和激活，从而导致下游效应分子（如Ras-ERK和PI3K-Akt）的持续激活，这些效应分子在肝细胞生长因子刺激下支持非锚定依赖性生长和增强的侵袭行为。整合素β4在稳态条件下能够成核半桥粒，而在生长因子或应激信号刺激下则能转变为具有信号传导能力并促进细胞迁移的状态，这种双重能力使其成为上皮细胞可塑性的核心调控因子，协调着稳定黏附和细胞运动之间的平衡。在临床标本中，α6β4从半桥粒错误定位到非连接膜区域与多种恶性肿瘤（包括乳腺癌、结直肠癌和肺癌）的侵袭性行为和不良预后相关；此外，β4依赖性信号传导与细胞在脱离应激下的存活率提高以及穿过基底膜样屏障的侵袭能力增强有关。 |
| 参考文献 |
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