Islet 1 Antibody (Rabbit mAb) [K5C1]
目录号: F5224
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: SH-SY5Y, Lane 2: Hela, Lane 3: A375, Lane 4: A431
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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39 kDa
39 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human small cell lung carcinoma tissue; Human pancreas tissue; Human gastric neuroendocrine carcinoma tissue; SH-SY5Y cells; HAP1 cells; HepG2 cells; HeLa cells; A375 cells; A431 cells; K562 cells; Jurkat cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| Islet 1 Antibody (Rabbit mAb) [K5C1] 可检测内源性 Islet 1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞核 |
| Uniprot ID |
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| P61371 |
| 克隆号 |
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| K5C1 |
| 别名 |
|---|
| Insulin gene enhancer protein ISL-1, Islet-1, ISL1 |
| 背景 |
|---|
| 胰岛-1 (ISL1) 是一种 LIM 家族的 LIM 同源域转录因子，在所有成年胰腺内分泌谱系中持续表达，并作为内分泌细胞分化、出生后胰岛增殖和 β 细胞基因表达的核心调控因子，整合发育信号与激素产生和分泌的转录调控。该蛋白包含两个 N 端 LIM 结构域，介导与 Ldb1、Set7/9 和 PDX-1 等辅助因子的蛋白-蛋白相互作用；以及一个 C 端同源域，可结合内分泌基因调控元件上的 DNA，形成模块化结构，将序列特异性的启动子和增强子识别与多蛋白转录复合物的组装相偶联。在胰腺发育过程中，ISL1 是胰腺内分泌祖细胞存活和分化所必需的，随后与辅助调控因子 Ldb1 共同作用，控制 α 细胞、β 细胞和 δ 细胞的发育；遗传学研究表明，Ldb1介导胰岛中大部分LIM-HD和LIM-only因子的活性，而Ldb1的缺失会破坏内分泌细胞的发育，这凸显了ISL1-Ldb1复合物驱动谱系特异性转录程序的通路。在出生后的胰腺中，ISL1通过调节胰岛素、MafA、Glut2和Pdx1等关键基因的表达来维持β细胞的特性和功能；β细胞中条件性敲除Isl1会导致胰岛素含量降低、葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损以及进行性糖尿病，这表明ISL1不仅对内分泌细胞的特化至关重要，而且对成熟β细胞的功能也必不可少。从机制上讲，ISL1通过形成ISL1/Set7/9/PDX-1复合物促进胰岛细胞增殖。该复合物结合参与β细胞生长和胰岛素合成的基因启动子，其中Set7/9提供组蛋白甲基转移酶活性，PDX-1则赋予胰腺谱系特异性。任何组分的破坏都会降低胰岛细胞增殖和胰岛素基因转录，从而构成一个协同转录模块，将染色质修饰与内分泌细胞的扩张联系起来。在更广泛的胰岛微环境中，ISL1依赖性转录与旁分泌和血管信号相互作用，共同塑造β细胞的结构和分泌行为。蛋白质组学和功能研究表明，ISL1调控的网络参与胰岛对代谢应激的适应，并将转录因子活性与2型糖尿病中脂质代谢、细胞因子信号传导和β细胞韧性的变化联系起来。 ISL1 及其共调节因子的基因或表达改变与 β 细胞增殖受损、胰岛素分泌缺陷和 2 型糖尿病易感性增加有关，ISL1 还与其他情况下的先天性心脏病和运动神经元发育有关，反映了 LIM-同源域转录模块在可兴奋组织中的重复使用。 |
| 参考文献 |
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