ITK Antibody (Rabbit mAb) [H23L5]
目录号: F4906
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Jurkat, Lane 2: MOLT4
操作要点
WB
建议曝光 60s 以上。
建议曝光 60s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, FCM |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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72 kDa
68 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | MOLT-4 cells; Jurkat cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| ITK Antibody (Rabbit mAb) [H23L5] 可检测内源性 ITK 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q08881 |
| 克隆号 |
|---|
| H23L5 |
| 别名 |
|---|
| EMT, LYK, ITK, Tyrosine-protein kinase ITK/TSK, Interleukin-2-inducible T-cell kinase, Kinase EMT, T-cell-specific kinase, Tyrosine-protein kinase Lyk, IL-2-inducible T-cell kinase |
| 背景 |
|---|
| ITK（白细胞介素-2诱导型T细胞激酶）是一种Tec家族非受体酪氨酸激酶，在胸腺细胞和外周T细胞中高度富集。它作为T细胞受体（TCR）信号传导的核心放大器，将受体结合与磷脂酶Cγ1激活、钙动员以及下游转录程序偶联，从而驱动T细胞的活化、分化和效应功能。该蛋白包含一个N端pleckstrin同源（PH）结构域，该结构域可结合质膜上PI3K生成的磷脂酰肌醇；其后是一个Tec同源区，该区域包含一个富含脯氨酸的片段、SH3和SH2结构域（可与衔接蛋白结合）；以及一个C端激酶结构域，该结构域的激活环酪氨酸可被Lck磷酸化。 TCR与肽-MHC复合物结合激活Lck和ZAP-70，导致CD3 ITAM和衔接蛋白LAT和SLP-76的磷酸化；PI3K活性同时产生PtdIns(3,4,5)P3，PtdIns(3,4,5)P3通过其PH结构域将ITK募集到富含LAT的膜微区，其SH2/SH3结构域与磷酸化的SLP-76和LAT结合，并将激酶定位，以便Lck在Y511位点进行跨磷酸化，随后在Y180位点进行自身磷酸化。活化的ITK在调节性酪氨酸上磷酸化PLCγ1，从而刺激PIP2水解为IP3和DAG； IP3触发细胞内Ca²⁺释放和持续的Ca²⁺内流，进而激活NFAT；而DAG激活Ras-MAPK和PKC通路，最终激活ERK、NF-κB和JNK，并协同诱导细胞因子基因和增殖相关程序的表达。对ITK功能的定量分析支持其作为信号调节器的作用：ITK活性分级调节NFAT和NF-κB输出之间的平衡，影响TCR信号的强度和持续时间，从而塑造T细胞命运的决定，包括胸腺阳性选择的阈值以及CD4⁺ T细胞向Th1、Th2、Th17或Th9谱系的分化。在小鼠和人类系统中，ITK缺陷会损害PLCγ1磷酸化、Ca²⁺信号传导和Th2细胞因子生成，导致对蠕虫感染的反应缺陷和抗病毒免疫功能改变；而完整的或增强的ITK信号传导则支持强大的Th2、Th9和Th17反应，这些反应与哮喘、过敏和某些自身免疫表型有关。ITK通过其调控结构域进行自身缔合，从而限制信号传导；人为破坏分子间自身缔合可增强其向LAT复合物的募集并增强NFAT的激活，这表明PH–TH–SH3–SH2模块中的分子内和分子间相互作用为激酶输出提供了额外的调控机制。 ITK 参与致癌融合，例如外周 T 细胞淋巴瘤中的 ITK-SYK 融合，其中组成型激酶活性驱动抗原非依赖性信号传导，并且已经开发出小分子 ITK 抑制剂，可以调节 TCR、CD28 和趋化因子驱动的反应，正在探索其在 T 细胞淋巴瘤、移植物抗宿主病和自身免疫性炎症中的应用，在这些疾病中，选择性抑制 T 细胞效应通路是可取的。 |
| 参考文献 |
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