JMJD2A Antibody (Rabbit mAb) [G6B24]
目录号: F4853
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 293T, Lane 2: LNCAP, Lane 3: PC12, Lane 4: 3T3
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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120 kDa
150 kDa,50 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human fetal kidney tissue; Human colon tissue; Rat colon tissue; HAP1 cells; U2OS cells; PC12 cells; HEK-293 cells; LNCaP cells; HeLa cells; NIH/3T3 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| JMJD2A Antibody (Rabbit mAb) [G6B24] 可检测内源性 JMJD2A 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞核 |
| Uniprot ID |
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| O75164 |
| 克隆号 |
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| G6B24 |
| 别名 |
|---|
| JHDM3A, JMJD2, JMJD2A, KIAA0677, KDM4A, Jumonji domain-containing protein 2A, [histone H3]-trimethyl-L-lysine(36) demethylase 4A, [histone H3]-trimethyl-L-lysine(9) demethylase 4A |
| 背景 |
|---|
| JMJD2A（又名KDM4A）是KDM4/JMJD2家族中的一种JmjC结构域赖氨酸去甲基酶，它靶向组蛋白H3和H1上转录相关的甲基化标记，以依赖于特定环境的方式重塑染色质，将其催化和支架功能与转录抑制、复制控制和谱系特异性基因激活联系起来。全长蛋白包含一个N端催化模块，该模块由JmjN结构域和Fe(II)/2-酮戊二酸依赖的JmjC结构域组成；其后是C端区域，该区域具有双PHD指状结构域和串联的Tudor结构域，能够识别甲基赖氨酸标记，并帮助JMJD2A定位到特定的染色质位点，从而实现底物识别和去甲基化的协同作用。 JMJD2A能够去除组蛋白H3第9位和第36位赖氨酸以及组蛋白H1.4第26位赖氨酸的三甲基化修饰，对H3K9me3和H1.4K26me3具有很高的催化效率，而对单甲基化或二甲基化修饰则几乎没有活性。该反应生成甲醛和琥珀酸，并直接逆转抑制性异染色质标记，从而抑制HP1蛋白的募集。JMJD2A对H3K9me3的去甲基化作用使HP1从染色质上解离，并与通常复制较晚的富含H3K9me3区域的染色质开放和复制时间提前相关。这表明JMJD2A不仅影响转录潜能，还通过拮抗HP1依赖的染色质组织来调节沉默区域的复制起始位点。在特定启动子处，JMJD2A 也作为转录共抑制因子发挥作用：它在体内与 pRb、HDACs 和 NCOR1 结合，并被募集到 E2F 反应启动子和 ASCL2 启动子，在那里它促进组蛋白去乙酰化并维持 H3K9 甲基化，从而强化抑制的染色质状态，限制细胞周期基因表达和谱系特异性转录。选择性剪接产生一种 N 端截短的异构体 (ΔN-JMJD2A)，该异构体缺乏催化性的 JmjC 去甲基化酶结构域，但保留了 C 端识别模块；该亚型在骨骼肌分化过程中积累，在肌生成初期结合Myog启动子，是肌管形成和肌肉基因表达所必需的。其存在与H3K9me2/3的丢失和转录激活相关，这与其指导其他去甲基化酶和共激活因子去除肌源性基因位点的抑制性标记的作用相一致。ΔN-JMJD2A在参与转录调控的基因中富集，而针对该亚型的外显子特异性siRNA敲低选择性地抑制了MyoD驱动的成纤维细胞向肌肉细胞的转化，进一步证实了其作为嵌入JMJD2A基因座的非催化性染色质结合共激活因子模块的功能。 JMJD2A 表达或活性失调会改变 H3K9me3/H3K36me3 和 H1.4K26me3 的整体水平，并导致异常的转录程序、DNA 复制压力和基因组不稳定，这与其消除异染色质标记、重新分布 HP1 以及与 HDAC 和 pRb/NCOR1 复合物在生长调节启动子上相互作用的双重能力相一致。 |
| 参考文献 |
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