K63-linkage Specific Polyubiquitin Antibody [P10B21]

目录号: F4175

抗体应用：反应性：All Species Expected

Lane 1: HeLa, Lane 2: HeLa (MG132, 10 µM, 6 h)

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

在未添加抑制剂的正常生理状态下，多聚泛素化蛋白会被快速降解或被去修饰，稳态丰度低，会导致WB无明显拖尾、仅显现个别高丰度稳定条带。
建议在细胞处理阶段加入蛋白酶体抑制剂（如 MG132），以积累多聚泛素化蛋白；在细胞裂解液中加入去泛素化酶抑制剂（如 NEM），防止提取过程中的泛素脱落。
为保证呈现全膜拖尾，总蛋白上样量建议提升至 30~60 μg。
建议首选梯度胶，兼顾不同分子量的泛素修饰蛋白。

使用信息

稀释比例
WB1:1000

抗体应用
WB

反应性
All Species Expected

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

阳性对照	HeLa cell (MG132, 10 µM, 6 h); HeLa cell; NIH/3T3 cell; C6 cell; COS-7 cell
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的组织裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。 PVDF 膜孔径规格选择参照表（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的组织裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
K63-linkage Specific Polyubiquitin Antibody [P10B21] 可检测内源性 K63-linkage Specific Polyubiquitin 总蛋白水平。

克隆号
P10B21

别名
N/A

背景
K63连接特异性多聚泛素是一种多聚泛素链，其中泛素分子通过赖氨酸63残基连接，属于泛素家族，该家族以调控除蛋白酶体降解之外的多种细胞过程而闻名。K63连接的链具有开放且灵活的构象，使其能够有效地与靶蛋白和调控酶中的多个泛素结合域相互作用。这些链发挥着重要的非降解作用，例如介导内吞作用中的蛋白质运输、激活激酶和磷酸酶信号通路，以及通过将特定的修复复合物募集到DNA损伤位点来促进DNA损伤修复。重要的是，K63连接的多聚泛素在免疫信号通路中发挥着关键作用，包括Toll样受体和白细胞介素-1受体通路。K63泛素化的失调与癌症等疾病相关，在这些疾病中，信号传导的改变会促进细胞存活并影响DNA修复。

背景

K63连接特异性多聚泛素是一种多聚泛素链，其中泛素分子通过赖氨酸63残基连接，属于泛素家族，该家族以调控除蛋白酶体降解之外的多种细胞过程而闻名。K63连接的链具有开放且灵活的构象，使其能够有效地与靶蛋白和调控酶中的多个泛素结合域相互作用。这些链发挥着重要的非降解作用，例如介导内吞作用中的蛋白质运输、激活激酶和磷酸酶信号通路，以及通过将特定的修复复合物募集到DNA损伤位点来促进DNA损伤修复。重要的是，K63连接的多聚泛素在免疫信号通路中发挥着关键作用，包括Toll样受体和白细胞介素-1受体通路。K63泛素化的失调与癌症等疾病相关，在这些疾病中，信号传导的改变会促进细胞存活并影响DNA修复。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35033428/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29871913/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%