Leptin Antibody (Mouse mAb) [D16P10]
目录号: F6204
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Recombinant human Leptin Protein
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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19 kDa
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| 阳性对照 | Recombinant human leptin |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Leptin Antibody (Mouse mAb) [D16P10] 可检测内源性 Leptin 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞外环境 |
| Uniprot ID |
|---|
| P41159 |
| 克隆号 |
|---|
| D16P10 |
| 别名 |
|---|
| Obese Protein, Obesity Factor, LEPD, OB, OBS |
| 背景 |
|---|
| 瘦素是一种脂肪细胞来源的肽类激素，属于I类细胞因子家族，它向大脑传递外周能量储备状态的信号。瘦素主要通过其受体（LepRb/Ob-Rb）的长信号亚型作用于下丘脑和下丘脑外神经元，从而协调食欲、能量消耗和神经内分泌功能。成熟的瘦素蛋白具有四螺旋束状的细胞因子样结构，可与靶细胞上的LepRb结合并促进受体二聚化，从而使相关的JAK2分子靠近，并允许JAK2与LepRb胞质尾部的酪氨酸残基发生反式磷酸化；这些磷酸化的酪氨酸残基随后作为STAT3、STAT5和SHP2的结合位点，启动平行的JAK2-STAT、MAPK/ERK和PI3K信号通路，进而调节控制食物摄入、产热、葡萄糖代谢和脂质代谢的转录程序。在弓状核内，LepRb 的激活会刺激厌食性 POMC/CART 神经元，并抑制食欲刺激性 NPY/AgRP 神经元，从而导致食欲下降和交感神经向棕色脂肪组织输出增加。同时，LepRb 信号在其他核团（例如腹内侧下丘脑、背内侧下丘脑、外侧下丘脑和视前区）中发挥作用，调节产热、心率、血压、昼夜节律性摄食以及在禁食或营养过剩期间能量消耗的适应性变化。瘦素还作为生殖和神经内分泌轴的许可因子，充足的循环瘦素水平支持正常的促性腺激素释放、甲状腺功能和肾上腺活动。在先天性或获得性瘦素缺乏的情况下，补充瘦素可使严重的性腺功能减退、甲状腺抑制以及其他神经内分泌系统对慢性能量不足的适应性改变恢复正常。在细胞水平上，LepRb驱动的STAT3信号通路会诱导SOCS3和蛋白酪氨酸磷酸酶等负反馈调节因子，从而减弱JAK2和受体磷酸化。这些因子与瘦素跨血脑屏障转运受损以及炎症/应激激酶共同作用，导致普通肥胖症中出现中枢性瘦素抵抗。普通肥胖症的特征是循环瘦素水平高，但下丘脑反应迟钝，外源性瘦素的减重效果有限。瘦素信号通路影响免疫反应、骨代谢和心血管功能。肥胖症中瘦素水平升高与高血压、动脉粥样硬化、心脏重塑和造血功能改变有关。减重后，生理性或药理学补充瘦素可部分逆转能量消耗和饥饿信号的适应性降低，目前正被探索作为一种维持体重而非单纯减重的手段。 |
| 参考文献 |
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