LINE-1 ORF1p Antibody (Mouse mAb) [M4G2]
目录号: F3274
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: MCF7
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议曝光 120s 以上。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议曝光 120s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC, IF |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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40 kDa
~42 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | MCF7 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| LINE-1 ORF1p Antibody (Mouse mAb) [M4G2] 可检测 LINE-1 逆转座子 ORF1p 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q9UN81 |
| 克隆号 |
|---|
| M4G2 |
| 别名 |
|---|
| LINE-1 retrotransposable element ORF1 protein, L1ORF1p, LINE retrotransposable element 1, LINE1 retrotransposable element 1 |
| 背景 |
|---|
| LINE-1 ORF1p 是一种逆转录转座子编码的 RNA 结合蛋白，它通过卷曲螺旋 N 端结构域组装成同源三聚体，并携带一个中央 RNA 识别基序和一个 C 端无序区，构成 LINE-1 核糖核蛋白颗粒的核心结构和功能组分，从而实现逆转录转座并调节宿主信号传导。卷曲螺旋介导三聚化和更高级的寡聚化，RRM 和 C 端尾部以广泛的特异性结合单链核酸，这些区域共同赋予 ORF1p 类似分子伴侣的活性，促进 L1 RNA 的退火、聚集和重塑，从而支持形成紧密堆积的 L1 核糖核蛋白 (RNP)，这些 RNP 能够被 ORF2p 逆转录，并且对其编码的 L1 转录本表现出很强的顺式偏好性。生物物理和结构研究表明，ORF1p核蛋白复合物能够快速形成不同的构象并经历液-液相分离，在L1 RNA上形成动态凝聚体。这些凝聚体的材料特性（粘度、可逆性以及对卷曲螺旋和无序尾部突变的敏感性）与逆转录转座效率密切相关，表明凝聚体的形成是L1 RNP组装和核定位的关键机制步骤。在有丝分裂过程中，含有ORF1p的凝聚体与染色质相互作用，结合DNA并与染色体结合，为L1 RNP在核膜破裂期间进入核环境以及将逆转录转座机制定位以进行插入事件提供了途径。在健康成人的体细胞组织中，ORF1p的表达大多受到抑制，但在癌症中，全长L1的去抑制和ORF1p的大量积累很常见，ORF1p在癌症中作为泛癌生物标志物，标记早期癌前病变。整合蛋白质组学分析表明，高表达ORF1p的肿瘤可分为两种类型：一种是免疫抑制状态，表现为干扰素信号传导减弱和免疫细胞浸润减少；另一种是免疫激活状态，这两种截然不同的免疫状态的根本原因在于癌症类型特异性的非整倍体和拷贝数变异。肺鳞状细胞癌的机制研究表明，致病性L1衍生的ORF1p通过其固有无序区发生相分离，形成胞质凝聚体，该凝聚体将L1核酸、HMGN2和cGAS组装成三元复合物；该复合物维持慢性非经典NF-κB依赖的cGAS-STING激活，这种激活非但不能促进经典的抗肿瘤免疫，反而会驱动富含髓源性抑制细胞的免疫抑制性微环境；而同时靶向L1和cGAS则可恢复抗肿瘤反应并抑制肿瘤生长。在神经退行性疾病中，应激诱导的人类神经元中 ORF1p 表达导致核转位并定位于核膜，在那里 ORF1p 与核输入因子、核孔复合体成分和核内层纤层相互作用；这些相互作用会损害核膜完整性，破坏核质运输并诱导异染色质紊乱，这些特征在帕金森病组织中观察到，而阻断 ORF1p 核输入或通过药物稳定核膜可以挽救这些缺陷，这表明 ORF1p 在核周具有不依赖于逆转录转座的致病作用。 |
| 参考文献 |
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