LYRIC/AEG1 Antibody (Rabbit mAb) [E12A5]
目录号: F6065
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: T47D, Lane 2: Hela, Lane 3: PC-3, Lane 4: PC-12
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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64 kDa
75 kDa,80 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Mouse cerebrum tissue; Rat cerebrum tissue; Human astrocytoma tissue; Human ovarian cancer tissue; Human lung cancer tissue; MCF7 cells; T-47D cells; HeLa cells; PC-3 cells; PC-12 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| LYRIC/AEG1 Antibody (Rabbit mAb) [E12A5] 可检测内源性 LYRIC/AEG1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞连接，细胞质，内质网，内膜系统，细胞核，细胞紧密连接 |
| Uniprot ID |
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| Q86UE4 |
| 克隆号 |
|---|
| E12A5 |
| 别名 |
|---|
| AEG1 | LYRIC | MTDH | Protein LYRIC | 3D3/LYRIC | Astrocyte elevated gene-1 protein | Lysine-rich CEACAM1 co-isolated protein | Metadherin | Metastasis adhesion protein | AEG-1 |
| 背景 |
|---|
| LYRIC/AEG1，又称星形胶质细胞高表达基因-1或metadherin (MTDH)，是由MTDH基因编码的多功能蛋白，定位于内质网、核周区和细胞核，并在驱动肿瘤发生、转移和治疗耐药性的信号传导和转录网络中发挥支架蛋白和衔接蛋白的作用。该蛋白富含赖氨酸，预计含有跨膜区段和卷曲螺旋区段，这些区段促进其与膜结合和蛋白质-蛋白质相互作用，使LYRIC/AEG1能够与信号分子和转录调节因子组装成复合物，而非作为经典酶发挥作用。在肝细胞癌中，LYRIC/AEG1显著上调，功能获得和功能丧失研究表明，LYRIC/AEG1正向调控肝细胞癌进展的多个标志性特征，包括增殖、血管生成、侵袭和转移。在小鼠中敲除 AEG-1 基因可抑制 DEN 诱导的肝癌发生，其机制是通过阻断 NF-κB 激活、抑制炎症和生存基因表达以及降低肿瘤负荷，表明 LYRIC/AEG1 是致癌物驱动的肝肿瘤发生和发展所必需的。从机制上讲，LYRIC/AEG1 激活了多个与肝细胞癌 (HCC) 相关的信号通路，包括 NF-κB、PI3K/Akt 和 Wnt/β-catenin 信号通路：过表达可增强 NF-κB 的核活性并上调血管生成和化疗耐药相关基因；临床研究表明，AEG-1 高表达与 β-catenin、c-Myc 和细胞周期蛋白 D1 的增加相关，这支持了其在增殖和干性程序转录激活中的作用。 LYRIC/AEG1 还影响自噬和细胞凋亡，并通过上调多药耐药基因和生存通路促进化疗耐药，因此其表达水平可预测化疗反应，并与肝细胞癌队列的不良预后相关。在乳腺癌中，AEG-1/MTDH/LYRIC 是预后不良肿瘤中常见的 8q22 基因组扩增的关键功能靶点，它在促进转移和化疗耐药方面发挥双重作用；过表达可增强肿瘤细胞在细胞毒性应激下的增殖、黏附、侵袭、血管生成和存活，而敲低则可减少转移扩散，并在异种移植模型中增强细胞对化疗药物的敏感性。在多种癌症类型中，临床病理学研究一致表明，LYRIC/AEG1高表达与晚期、高级别组织学分级、微血管密度增加和血行转移相关，血清抗AEG-1抗体滴度可作为侵袭性疾病的预测指标，凸显了其作为组织和血液生物标志物的潜力。这些数据，以及LYRIC/AEG1位于NF-κB、PI3K/Akt、Wnt/β-catenin和自噬通路交汇处并调控增殖、侵袭、血管生成和化疗耐药相关基因表达变化的证据，共同将LYRIC/AEG1定义为一种结构可塑性强、机制核心的致癌调控因子，对于研究信号通路驱动的肿瘤生物学以及探索肝癌、乳腺癌和其他癌症靶向治疗的研究人员而言具有重要意义。 |
| 参考文献 |
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