Lysozyme C Antibody [J12N14]
目录号: F6946
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: U937
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：20%。
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：20%。
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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15 kDa
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| 阳性对照 | Human squamous cell lung carcinoma cells; Human colon adenocarcinoma cells; Normal human small intestine cells; Normal human lung adjacent to sarcoma cells; Normal human salivary gland cells; Normal human kidney cells; MOLM‑13 cells; U‑937 cells; OCI‑AML2 cells; Hep G2 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | HeLa cells; A549 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Lysozyme C Antibody [J12N14] 可检测内源性 Lysozyme C 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 淀粉样蛋白，细胞外环境 |
| Uniprot ID |
|---|
| P61626 |
| 克隆号 |
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| J12N14 |
| 别名 |
|---|
| Lysozyme C; LYZ |
| 背景 |
|---|
| 溶菌酶C属于经典的C型溶菌酶家族，在哺乳动物的先天免疫中发挥着关键作用。它能水解细菌肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的β-1,4-糖苷键，破坏细胞壁的完整性，从而促进微生物的清除。溶菌酶C由人类LYZ基因及其小鼠同源基因Lyz1和Lyz2编码，其结构紧凑，由α螺旋和β折叠构成底物结合裂隙，该裂隙定位了关键的催化残基，特别是Glu35和Asp52，从而通过酸碱催化和Asp52处共价中间体的形成，稳定水解过程中的过渡态。溶菌酶C分泌于泪液、唾液、乳汁和尿液等黏膜液中，也可由巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等吞噬细胞产生。溶菌酶C通过其活性位点裂隙与肽聚糖结合，在Glu35质子化和亲核攻击之前，诱导可裂解键的应力，产生裂解产物，从而削弱革兰氏阳性菌的细胞壁。在脑内驻留巨噬细胞——小胶质细胞中，溶菌酶1（Lyz1）和溶菌酶2（Lyz2）表现出独特的表达模式。在阿尔茨海默病模型中，神经元活动受到刺激后，溶菌酶2表达上调，这与β-淀粉样蛋白的吞噬和降解增强直接相关。溶菌酶与β-淀粉样蛋白42发生物理相互作用，结合单体和寡聚体，从而改变聚集途径，使其远离毒性物质。在神经元共表达实验中观察到，溶菌酶可降低可溶性和不溶性β-淀粉样蛋白的水平，同时在果蝇模型中维持果蝇的活力和运动能力。在人类阿尔茨海默病患者脑组织和转基因小鼠中，脑脊液中溶菌酶水平升高伴随淀粉样斑块的共定位，表明溶菌酶C是神经炎症反应中的一个响应元件，它能够调节斑块相关的病理变化，而不会改变β-淀粉样蛋白的总产量。 |
| 参考文献 |
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