MAFA Antibody (Rabbit mAb) [N15J3]
目录号: F4996
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 293T, Lane 2: 293T (hMAFA transfected)
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IF, ChIP |
| 反应性 |
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| Human, Mouse |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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37 kDa
195 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Adult mouse pancreas; β-TC-6 cells; NIT-1 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | C2C12 cells; NIH/3T3 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| MAFA Antibody (Rabbit mAb) [N15J3] 可检测内源性 MAFA 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞核 |
| Uniprot ID |
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| Q8NHW3 |
| 克隆号 |
|---|
| N15J3 |
| 别名 |
|---|
| hMafA; INSDM; MAF bZIP transcription factor A; MAFA; v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog A (avian) |
| 背景 |
|---|
| MAFA是MAF碱性亮氨酸拉链转录因子家族的成员，它作为一种β细胞特异性调节因子，赋予胰岛素基因以及参与刺激-分泌偶联和激素加工的一系列更广泛的β细胞基因以组织特异性和葡萄糖反应性。该蛋白包含一个N端转录激活结构域，整合了葡萄糖和激酶依赖性调控信号；以及一个C端碱性亮氨酸拉链结构域，介导其二聚化并与顺式调控区域（例如胰岛素启动子的C1/RIPE3b元件）内的Maf识别元件结合。在C1/RIPE3b元件处，MAFA与PDX1和NEUROD1协同作用，驱动β细胞选择性转录。葡萄糖在转录和翻译后水平上调控MAFA。高葡萄糖水平可增加MAFA的表达和DNA结合活性，糖原合成酶激酶3 (GSK3) 可对MAFA的多个N端丝氨酸和苏氨酸残基进行组成型磷酸化，从而调节蛋白质稳定性。因此，环境葡萄糖水平的变化会改变MAFA的周转率，进而影响胰岛素启动子的结合。MAFA直接激活胰岛素基因，并控制着一系列与胰岛素生物合成、代谢-分泌偶联和肠促胰岛素反应密切相关的β细胞基因网络，包括GLUT2、葡萄糖激酶、PDX1、NKX6.1、GLP1R、PCSK1和丙酮酸羧化酶。这些基因网络在生理条件下协调葡萄糖摄取、代谢通量、胰岛素原加工和分泌能力。 MAFA的表达主要局限于成年胰岛内的胰岛素分泌β细胞。在β细胞分化的第二波过程中，MAFA的出现标志着成熟β细胞特性的获得和强大的胰岛素分泌功能的建立；而在糖尿病状态下，MAFA水平降低伴随慢性高血糖和β细胞功能障碍。MAFA的过表达可增强胰岛素转录、胰岛素含量和葡萄糖刺激的胰岛素分泌，而显性负性MAFA则会抑制这些作用并下调关键的β细胞基因，这表明MAFA位于维持成熟β细胞表型和在代谢负荷下保持分泌功能的转录层级的顶端。MAFA还参与β细胞重编程策略，其与PDX1和NEUROD1的共表达可有效诱导非β细胞中的胰岛素生物合成，并促进胰岛α细胞和祖细胞向β细胞样状态转化，这从机制上将该因子与胰岛内分泌细胞的谱系分化和可塑性联系起来。 MAFA 及其调节磷酸化位点的种系或功能改变与胰岛素基因表达受损、β 细胞衰竭和单基因糖尿病表型相关，MAFA 下调是人类 2 型糖尿病胰岛的一个一致分子特征。 |
| 参考文献 |
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