MAVS Antibody (Rabbit mAb) [H8N11]
目录号: F5024
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: A549, Lane 2: MCF-7, Lane 3: PC3 -
Immunofluorescent analysis of MCF-7 cells using F5024 (green, 1:100 ), Hoechst (blue) and tubulin (Red).
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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56 kDa
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| 阳性对照 | MCF7 cells; THP-1 cells; A549 cells; RT4 cells; PC-3 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| MAVS Antibody (Rabbit mAb) [H8N11] 可检测内源性 MAVS 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 内膜系统，线粒体，线粒体外膜，过氧化物酶体 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q7Z434 |
| 克隆号 |
|---|
| H8N11 |
| 别名 |
|---|
| Mitochondrial antiviral-signaling protein, MAVS, Virus-induced-signaling adapter (VISA), MAVS, IPS1, KIAA1271, VISA |
| 背景 |
|---|
| MAVS（线粒体抗病毒信号蛋白；也称VISA/IPS-1/Cardif）是一种含有CARD结构域的衔接蛋白，锚定于线粒体外膜及相关细胞器膜上，作为RIG-I样受体检测病毒RNA的中心信号枢纽，将瞬时胞质传感器结合转化为朊病毒样信号通路，进而驱动IRF和NF-κB激活以及I型干扰素的产生。该蛋白的结构包含一个N端CARD结构域，介导与RIG-I和MDA5的CARD结构域的同型相互作用；一个富含脯氨酸的中央片段，可募集TRAF E3连接酶和其他支架蛋白；以及一个C端跨膜螺旋，将MAVS锚定于线粒体、过氧化物酶体和线粒体相关内质网膜上，从而将信号转导平台定位于细胞内的特定位点。 RIG-I/MDA5在感知到病毒RNA后，发生K63连接的泛素化和寡聚化，并与MAVS CARD结合，触发MAVS构象转变，形成具有朊病毒样特性的高级丝状聚集体。这些聚集体沿线粒体网络自我复制，并形成包含TRAF2/3/5/6、TANK、TBK1和IKKα/β/γ复合物的大型信号复合物。这些聚集体驱动IRF3/IRF7和IκB的磷酸化，导致IRF和NF-κB转录因子入核，并协同诱导I型和III型干扰素、促炎细胞因子和抗病毒效应基因的表达。此外，MAVS依赖性通路还通过caspase-8与细胞凋亡机制相互作用，最终清除受感染的细胞。小鼠 MAVS 基因的消融可消除大多数细胞类型中 RIG-I/MDA5 介导的 IFN 诱导和 IRF3/NF-κB 激活，使动物无法对 RNA 病毒产生有效的先天免疫反应，并在 poly(I:C) 攻击或感染多种 RNA 病毒后导致高病毒载量和死亡，同时 TLR 和胞质 DNA 依赖的 IFN 通路基本保持完整，这表明 MAVS 是抗病毒免疫 RLR 分支所必需的。 MAVS 的翻译后调控，特别是泛素化，提供了额外的信号调节层面：多种 E3 连接酶（包括 TRIM31 和 MARCH5）介导的 K63 连接泛素化促进 MAVS 聚集和信号传导能力，而 RNF125 等连接酶介导的 K48 连接泛素化则将 MAVS 靶向蛋白酶体降解并终止信号传导，越来越多的去泛素化酶去除这些泛素链以重置该通路，总而言之，MAVS 的泛素化状态是抗病毒反应的幅度和持续时间的关键决定因素。多种 RNA 和 DNA 病毒（包括 HCV、小核糖核酸病毒和疱疹病毒）编码蛋白酶或线粒体调节剂，这些蛋白酶或调节剂能够切割或将 MAVS 从膜上置换下来，破坏其聚集，或操纵其泛素化，这凸显了衔接蛋白在宿主-病毒界面上的核心地位，并强调了 MAVS 既是病原体攻击的脆弱点，也是调节先天免疫和炎症病理的潜在治疗节点，其作用范围不仅限于经典的病毒感染，例如败血症和无菌性组织损伤。 |
| 参考文献 |
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