MBNL2 Antibody (Mouse mAb) [H9D23]
目录号: F8230
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: SK-N-SH, Lane 2: Hela, Lane 3: U87MG, Lane 4: Mouse brain -
Immunofluorescent analysis of SK-N-SH cells using F8230 (green, 1:50), Hoechst (blue) and tubulin (Red).
操作要点
WB
建议一抗稀释比: 1:100
建议一抗稀释比: 1:100
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC, IF |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
|---|
| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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41 kDa
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| 阳性对照 | Human cerebral cortex tissue; Human ovary tissue; Mouse brain tissue; Caki‑1 cells; SK‑N‑SH cells; HeLa cells; U‑87 MG cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:100），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| MBNL2 Antibody (Mouse mAb) [H9D23] 可检测内源性 MBNL2 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q5VZF2 |
| 克隆号 |
|---|
| H9D23 |
| 别名 |
|---|
| Muscleblind-like protein 2, Muscleblind-like protein 1, Muscleblind-like protein-like, Muscleblind-like protein-like 39, MBNL2, MBLL, MBLL39, MLP1 |
| 背景 |
|---|
| MBNL2 是一种 RNA 结合蛋白，属于肌肉盲蛋白样蛋白家族，它调控前体 mRNA 的选择性剪接和其他转录后过程，并在脑、心脏和骨骼肌中高表达，参与发育和组织特异性 RNA 程序。该蛋白包含四个 C3H 型锌指 RNA 结合结构域，呈两对串联排列，能够识别富含 YGCY 的序列基序，例如内含子和 3′UTR 中的 5′ ACACCC 3′，从而实现外显子插入的位置依赖性激活或抑制，并调控 mRNA 的定位和稳定性。MBNL2 在转录过程中与前体 mRNA 结合，控制众多靶标的选择性剪接，对某些转录本发挥剪接抑制作用，而对另一些转录本则发挥剪接激活作用；在肌肉细胞中，它抑制特定心肌肌钙蛋白 T 外显子的插入，同时促进特定胰岛素受体外显子的插入；在血管平滑肌细胞中，它与 RBPMS 和 RBFOX2 协同作用，驱动收缩型剪接程序。 MBNL2 与 MBNL1 和 MBNL3 的功能部分冗余，部分特化；这三个旁系同源蛋白均结合相似的 YGCY 基序，但在 CUG 扩增的 RNA 上表现出不同的结合亲和力、剪接能力和迁移率，因此 MBNL2 对整个 MBNL 依赖性剪接网络产生独特的定量和定性影响。转录组范围的分析表明，包括 MBNL2 在内的 MBNL 蛋白是发育程序性剪接开关的调节因子，这些开关通过重新定位编码离子通道、细胞骨架蛋白和信号分子中调控基序的外显子，将肌肉和大脑中的胚胎模式转化为成体亚型。此外，MBNL 依赖性调控还延伸至神经突中的 mRNA 定位和 3′UTR 加工。在1型强直性肌营养不良症及相关微卫星扩增疾病中，扩增的CUG或CCUG重复RNA形成核内聚集灶，这些聚集灶能够结合并隔离MBNL蛋白，包括MBNL2，从而导致MBNL2正常活性丧失，破坏许多前体mRNA发育调控的剪接，并重新表达与肌无力、心脏传导异常和中枢神经系统表现相关的胎儿亚型。MBNL2还参与DNA损伤和应激反应；在缺氧和基因毒性条件下诱导MBNL2表达可稳定CDK抑制剂p21转录本，并影响细胞周期阻滞和存活，从而将MBNL2依赖的RNA调控与检查点通路和应激适应联系起来。 MBNL2 表达的改变会影响转移和上皮-间质转化，MBNL2 通过调节 PI3K/Akt 连接的 EMT 调节因子以及影响粘附、细胞骨架动力学和信号成分的剪接网络的更广泛变化来调节癌细胞的迁移和侵袭。 |
| 参考文献 |
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