mCherry Antibody (Rabbit mAb) [P15F10]
目录号: F9404
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 293T, Lane 2: 293T (mCherry C-tagged transfected)
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IF |
| 反应性 |
|---|
| All Species Expected |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的组织裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。 PVDF 膜孔径规格选择参照表
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| mCherry Antibody (Rabbit mAb) [P15F10]可检测细胞中外源表达的 mCherry 标记蛋白（N 端标记或 C 端标记）。 |
| Uniprot ID |
|---|
| X5DSL3 |
| 克隆号 |
|---|
| P15F10 |
| 别名 |
|---|
| mCherry; MCherry fluorescent protein |
| 背景 |
|---|
| mCherry是一种单体红色荧光蛋白，由源自Discosoma sp.珊瑚的前体基因工程改造而成，属于mFruit家族。它被设计成一种基因编码的报告蛋白，在保持红色荧光发射的同时，相比之前的四聚体红色荧光蛋白，降低了聚集和细胞毒性。该蛋白折叠形成β桶状支架，包裹着由自身残基自催化环化和氧化形成的内生色团，从而构建了一个刚性的屏蔽环境，稳定了激发态，并在生理条件下支持高效的红色荧光。mCherry的生色团环境决定了其特征性的红移激发和发射光谱。通过对生色团口袋周围的氨基酸进行靶向替换，可以调节质子化平衡和电子跃迁，从而生成具有长斯托克斯位移或红移光谱的变体。这表明，局部侧链组成可以在不破坏整体单体折叠的情况下调节吸收-发射耦合。在活细胞中，mCherry 作为一种组成型荧光标签，与靶蛋白融合后可报告蛋白质的定位、丰度和动态变化。对哺乳动物细胞中 mCherry 融合蛋白的荧光波动光谱分析表明，该蛋白保持了与单分子水平寡聚化和复合物形成分析相兼容的亮度和扩散特性。mCherry 在拥挤的细胞内环境中的光物理行为支持对亮度、分子数量和迁移率进行定量测量，并且其光谱与绿色荧光蛋白的分离使得双色相关和互相关方法可用于解析标记伙伴的协同或独立运动。源自同一骨架但具有不同激发-发射光谱的变体扩展了这些应用，实现了多重成像，并为在特定光照条件下工作的报告分子提供了模板，同时保持了低细胞毒性和单体行为。在细菌系统中，包括严格厌氧菌和植物病原菌，密码子优化的 mCherry 构建体在特定启动子下作为转录和翻译报告基因发挥作用，并且作为 C 端或 N 端融合体，可以解析周质与细胞质定位，从而在不损害细菌活力或毒力的情况下，精确绘制膜相关蛋白和胞质蛋白的分布图。 |
| 参考文献 |
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