MEK2 Antibody (Rabbit mAb) [C14M9]
目录号: F9486
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Jurkat, Lane 2: K562, Lane 3: Mouse brain, Lane 4: Mouse lung
操作要点
WB
建议一抗稀释比: 1:10000
建议一抗稀释比: 1:10000
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Mouse, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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44 kDa
44 kDa, 45 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human prostate carcinoma tissue; Mouse brain tissue; Mouse lung tissue; Jurkat cells; HeLa cells; HAP1 cells; HCT 116 cells; HEK-293T cells; K562 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| MEK2 Antibody (Rabbit mAb) [C14M9] 可检测内源性 MEK2 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| P36507 |
| 克隆号 |
|---|
| C14M9 |
| 别名 |
|---|
| MEK2, MKK2, PRKMK2, MAP2K2, Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 2, MAP kinase kinase 2, MAPKK 2, ERK activator kinase 2, MAPK/ERK kinase 2, MEK 2 |
| 背景 |
|---|
| MEK2 (MAP2K2) 是一种双特异性蛋白激酶，属于 MAP 激酶激酶家族。它与其旁系同源物 MEK1 共同构成经典 RAS-RAF-MEK-ERK 信号级联的核心激活层，将促分裂原和生长因子信号传递给 ERK1/2，从而调控细胞增殖、分化、存活和代谢。该酶包含一个 N 端调控区（带有 ERK 和支架蛋白的结合位点）、一个双叶蛋白激酶结构域（包含保守的激活片段）以及一个短的 C 端尾部。MEK1 和 MEK2 的催化结构域具有高度序列同源性，并且具有相似的三维折叠结构。这已通过与 MgATP 和非竞争性抑制剂形成的三元复合物晶体结构得到证实。这些抑制剂结合于核苷酸位点附近的一个独特口袋，并将未磷酸化的酶锁定在一个封闭但催化失活的构象中。 MEK2的激活发生在RAF激酶的下游，RAF激酶通过KSR支架蛋白协调磷酸化其激活环中的丝氨酸残基（类似于MEK1的S218/S222）；磷酸化后的MEK2磷酸化ERK1（MAPK3）和ERK2（MAPK1）TEY基序中的苏氨酸和酪氨酸残基，从而触发ERK的核转位，并调控控制细胞周期进程、细胞凋亡和分化的基因的转录。结构和生化研究表明，MEK1和MEK2可以形成异二聚体，并且Raf诱导的KSR变构转变会刺激MEK的磷酸化，这凸显了一个多蛋白调控模块，其中MEK1/2的构象、与支架蛋白的结合以及激活环的磷酸化共同决定了ERK信号的强度和持续时间。在人类疾病中，大约三分之一的癌症中检测到了 RAF–MEK–ERK 级联的异常激活，这主要由致癌的 RAF 或 RAS 突变驱动。MEK1 的组成性激活已被证明可以转化细胞，而组成性活性 MEK2 突变体的表达同样会诱导致癌表型，这证实了 MEK1/2 是肿瘤发生过程中 ERK 活性的关键“守门人”。尽管 MEK2 突变相对少见，但种系 MAP2K2 变异会导致 RAS 病综合征，例如努南综合征。在 Mek2 缺失的背景下选择性删除 Mek1 的小鼠等位基因系列揭示了同工型特异性作用：MEK1 和 MEK2 的完全缺失与正常寿命相符，但部分 MEK 剂量会导致肾小球肾炎或淋巴增生性疾病，这是由于 B 细胞和 T 细胞活化失调所致。这表明，对含有 MEK2 的 ERK 信号进行精细调节对于限制淋巴细胞活化和自身免疫至关重要。 |
| 参考文献 |
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